常 裕，何亞蓉，王凱琪，齊向英

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

山丹丹學(xué)名山丹(Liliumpumilum.DC)為百合科百合屬多年生草本植物[1]。山丹丹是延安市市花，不僅可以作觀景花卉，還有許多藥用價值。關(guān)于山丹丹的組織培養(yǎng)，國內(nèi)有不少的研究者開展了大量的工作。以山丹丹的鱗片為材料的研究結(jié)果表明，山丹丹鱗片在不同濃度的IBA和NAA濃度組合中明顯表示出不同的適應(yīng)性[2]。王凱[3]等以南泥灣野生山丹丹鱗莖為材料建立野生山丹丹快繁和植株再生系統(tǒng)。但目前國內(nèi)對山丹丹外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織分化研究尚未見報道。本研究通過對山丹丹愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)后，再進(jìn)行分化培養(yǎng)，研究山丹丹愈傷組織分化成植株的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用材料為延安地區(qū)野生山丹丹鱗片誘導(dǎo)形成的愈傷組織，由延安市寶塔區(qū)山丹生物科技有限公司提供，保存于陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 繼代培養(yǎng)

將山丹丹愈傷組織在無菌條件下用鑷子夾碎成0.5 cm×0.5 cm的小方塊，接入到繼代培養(yǎng)基MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.2 mg/L+TDZ 0.01 mg/L+蔗糖25 g/L，pH=6.8。每瓶5小塊愈傷組織，于25℃光照條件下培養(yǎng)20 d。

1.2.2 分化培養(yǎng)

分化培養(yǎng)基設(shè)計采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行(表1)，所有培養(yǎng)基添加蔗糖25 g/L，pH=6.8。在無菌條件下將繼代培養(yǎng)20 d的愈傷組織再次用鑷子夾碎成0.5 cm×0.5 cm的小方塊轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基中。每個處理組合接種20瓶，每瓶接種5塊，每個處理共計100塊。接種后在散光條件下培養(yǎng)7 d然后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)。以繼代培養(yǎng)為對照組。

表1 因素水平表

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度控制在24±2℃，光照強(qiáng)度為1500±200 lx，光照時間12 h/d，相對濕度為60%～75%。

1.4 統(tǒng)計與分析

散光培養(yǎng)結(jié)束后，每周觀察1次，統(tǒng)計分化情況，以每塊愈傷組織分化出2個及2個以上芽體確定為分化，統(tǒng)計計數(shù)為1，分化出2個以下芽體統(tǒng)計計數(shù)為0.5。在第28 d時結(jié)束統(tǒng)計，并以第28 d統(tǒng)計結(jié)果做實(shí)驗(yàn)分析。

分化率=已分化愈傷組織塊數(shù)/總接種愈傷組織塊數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

山丹丹愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基中3 d后，愈傷組織開始有部分變成綠色。經(jīng)過7 d培養(yǎng)愈傷組織明顯增大，14 d左右有部分愈傷組織的側(cè)面開始逐漸褐化，在培養(yǎng)的第19 d從褐化部位中間開始分化出芽體(見圖1)，這時的芽體表現(xiàn)為細(xì)小的葉片。第28 d時每1個處理組合中均不同程度的分化出小芽體。分化出芽體的數(shù)量各不相同，最多的一塊愈傷組織上分化出12個小葉片。

圖1 分化出芽體的愈傷組織

對統(tǒng)計結(jié)果計算分析，計算分化率見表2。在所有培養(yǎng)基組合中F1：MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+TDZ 0 mg/L中分化率達(dá)到了72.72%。確定為本研究的最佳培養(yǎng)基。由于TDZ在該培養(yǎng)基中并沒有添加，所以最終確定為MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L，pH=6.8。

表2 28 d后愈傷組織分化培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)過極差分析發(fā)現(xiàn)，RTDZ=21.74、R6-BA=15.45、RIBA=11.59，說明在該正交設(shè)計中對愈傷組織分化的影響大小依次為TDZ>6-BA>IBA。但從整個分化培養(yǎng)的結(jié)果來看，隨著TDZ濃度的增大，愈傷組織的分化率一直呈現(xiàn)出降低的趨勢，說明山丹丹愈傷組織分化培養(yǎng)中TDZ是非必須的外源激素。以6-BA作為單個因子統(tǒng)計結(jié)果顯示，TDZ 0水平是F1(72.72)>F6(51.85)>F8(42.86)。經(jīng)過極差分析整個分化過程隨著6-BA濃度的增加分化率呈下降趨勢。以IBA作為單個因子統(tǒng)計結(jié)果顯示，隨著IBA濃度的增加分化率呈先下降后升高。

3 討論

外源激素在百合愈傷組織分化培養(yǎng)中起到關(guān)鍵性作用。在東方百合“bernini”花蕾的研究表明，誘導(dǎo)其愈傷組織分化的最佳分化培養(yǎng)基為MS+KT 0.1 mg/L+BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L[4]。東方百合元帥“Acapulco”、提拔“Tiber”和西伯利亞“Siberia”研究結(jié)果顯示，幼葉的胚性愈傷組織在MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上能高頻再生出芽，而花絲的胚性愈傷組織在MS+BA 1.5 mg/L+KT 0.3 mg/L+IBA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上能高頻再生出芽[5]。以“索邦”百合鱗莖為材料誘導(dǎo)愈傷組織并分化的研究顯示，1/2MS+2.4-D 2.0 mg/L適合其植株再生[6]。這幾種百合都屬于大花百合，一般為園藝栽培種，由于愈傷組織的起始材料不相同，在分化培養(yǎng)中使用的激素種類和濃度也有所不同。本研究中山丹丹屬于野生百合，研究結(jié)果和這些百合存在差異。相同點(diǎn)是這些百合愈傷組織分化過程中使用的激素在山丹丹愈傷組織分化培養(yǎng)中也能表現(xiàn)出分化的特征，只是效果有所差異。

在我國野生百合淡黃花百合上的研究發(fā)現(xiàn)，以珠芽為材料可以在MS+TDZ 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2.4-D 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上，實(shí)現(xiàn)一次性誘導(dǎo)愈傷組織和分化小芽體[7]。同樣的研究結(jié)果在綠花百合以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2.4-D 0.1 mg/L的培養(yǎng)基中也有表現(xiàn)[8]。這些研究為山丹丹從鱗片或者其它外植體一次性誘導(dǎo)形成芽體提供了思路。宜興百合的研究在MS+NAA 0.15 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.01～0.1 mg/L的分化培養(yǎng)基[9]和宜昌百合在MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L的分化培養(yǎng)基上都比較適合誘導(dǎo)小芽體[10]，同時在這兩個研究中均表現(xiàn)出褐化的現(xiàn)象，也出現(xiàn)了褐化后仍舊能分化出小芽體的現(xiàn)象，這和本研究十分相似。麝香百合以MS+2.4-D 2.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最佳[11]，這種培養(yǎng)基處理的愈傷組織連續(xù)培養(yǎng)8年都可成功獲得完整植株。