◎ 亓希武，房海靈，陳澤群，梁呈元，呂 寒

（江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

桃膠是桃等薔薇科植物的樹干受到機(jī)械損傷或病原菌侵染后分泌的物質(zhì)，顏色為淡黃色至黃褐色或桃紅色。桃膠自然風(fēng)干或用其他方法脫水干燥后形成的固體物質(zhì)稱為原桃膠，原桃膠經(jīng)去雜、水解、脫色、干燥等工藝加工后可得商品桃膠[1]。商品桃膠的性質(zhì)與阿拉伯膠類似，在食品、化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[2-3]。此外，桃膠具有藥食兼?zhèn)涞奶攸c(diǎn)，研究表明其具有降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[4-6]。

桃膠的主要成分為多糖，此外還含有少量雜質(zhì)和蛋白質(zhì)[7]。在桃膠多糖的制備工藝中，脫蛋白是提高桃膠多糖純度和品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)以桃膠水解液為原料，以蛋白脫除率和多糖保留率為主要指標(biāo)，對(duì)常用的Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、木瓜蛋白酶法和鹽酸法這4種脫蛋白方法進(jìn)行了比較研究[8-10]，以確定適用于桃膠多糖制備的脫蛋白工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃膠采自江蘇省南京市棲霞區(qū)八卦洲街道桃園；Bradford法蛋白測(cè)定試劑盒、木瓜蛋白酶，購(gòu)自生工生物工程上海（股份）有限公司；Na2CO3、NaHCO3、蒽酮、硫酸、TCA、鹽酸、葡萄糖、牛血清白蛋白、氯仿和正丁醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、Quintix5100-1CN型電子天平（Sartorius）、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、UV-1600PC分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）、Bio-Rad iMARK酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、KYC-100B恒溫?fù)u床（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）及CF16RN型高速冷凍離心機(jī)（HITACHI）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桃膠水解液的制備

桃膠經(jīng)去雜、漂洗、冷凍干燥后粉碎，過(guò)40目篩，按照料液比1∶50加入堿水解液（0.1 mol·L-1Na2CO3-NaHCO3溶液，pH=10.3），85 ℃恒溫?cái)嚢杷? h，5 000 r·min-1離心15 min，得上清液為桃膠水解液。

1.3.2 多糖含量測(cè)定

多糖含量測(cè)定使用蒽酮比色法[11]。首先繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將葡萄糖在105 ℃條件下烘干至恒重，配制0.1 mg·mL-1葡萄糖溶液，分別取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL葡萄糖溶液于試管中，加入蒸餾水補(bǔ)足至0.5 mL，之后分別加入2.5 mL蒽酮試劑，混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫。以0號(hào)作為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)測(cè)定其在620 nm下的吸光值。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。桃膠水解液中多糖含量使用相同方法測(cè)定。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定使用Bradford法。首先繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別取1 mg·mL-1牛血清白蛋白0 μL、3 μL、6 μL、12 μL、18 μL、24 μL、30 μL和45 μL于離心管中，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）補(bǔ)足至300 μL，獲得不同濃度的蛋白溶液。分別取不同濃度的蛋白溶液20 μL于酶標(biāo)板中，之后每孔分別加入200 μL Bradford溶液，迅速混勻后室溫靜置5 min，之后在酶標(biāo)儀中測(cè)量其在595 nm下的吸光值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。桃膠水解液中蛋白質(zhì)含量使用相同方法測(cè)定。

1.3.4 Sevage法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，加入1/4體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），置于搖床中200 r·min-1振蕩1 h，之后5 000 r·min-1離心10 min，棄去中間層的蛋白質(zhì)和下層有機(jī)相，向上層溶液中重新加入1/4體積的Sevage試劑，重復(fù)振蕩、離心操作5次。每次離心分層后吸取少量上層溶液用于測(cè)定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 TCA法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，分別加入20%濃度的TCA至終濃度為2%、4%、6%、8%和10%，置于搖床中200 r·min-1振蕩1 h，之后在4 ℃條件下靜置過(guò)夜，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于測(cè)定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 酶法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，使用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，分別加入木瓜蛋白酶至1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，55 ℃下酶解3 h，之后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于測(cè)定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 鹽酸法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，分別加入1 mol·L-1鹽酸至鹽酸終濃度為0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1和0.6 mol·L-1，置于搖床中200 r·min-1振蕩2 h，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于測(cè)定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.8 評(píng)價(jià)指標(biāo)

分別計(jì)算不同脫蛋白條件下的多糖保留率和蛋白脫除率，計(jì)算公式：多糖保留率=脫蛋白后多糖含量/脫蛋白前多糖含量×100%；蛋白脫除率=（脫蛋白前蛋白質(zhì)含量-脫蛋白后蛋白含量）/脫蛋白前蛋白質(zhì)含量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sevage法脫蛋白

Sevage法脫蛋白結(jié)果如圖1所示，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白脫除率迅速提高，5次脫蛋白后蛋白脫除率達(dá)到91.25%，但1次（89.64%）和5次之間提高并不明顯；與之相對(duì)地，多糖保留率隨著脫蛋白次數(shù)的增加逐漸緩慢降低，從1次的86.71%下降至5次的77.33%。綜合兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，Sevage法脫蛋白4次，整體脫蛋白效果較好，桃膠多糖的蛋白脫除率（89.64%）和多糖保留率（82.47%）都在較高水平上。

圖1 Sevage法脫蛋白次數(shù)對(duì)桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

2.2 TCA法脫蛋白

TCA法脫蛋白結(jié)果如圖2所示，隨著TCA濃度的增加，蛋白脫除率逐漸上升，當(dāng)TCA濃度為10%時(shí)，蛋白脫除率達(dá)到82.55%；與之相對(duì)的，多糖保留率隨著TCA濃度的增加逐漸降低。綜合兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，當(dāng)TCA濃度為6%時(shí)對(duì)桃膠多糖的脫蛋白效果較好，此時(shí)蛋白脫除率為75.44%，多糖保留率為84.66%。

圖2 TCA濃度對(duì)桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

2.3 酶法脫蛋白

木瓜蛋白酶法脫蛋白結(jié)果如圖3所示，隨著木瓜蛋白酶濃度的增加，蛋白脫除率逐步增加，但整體處在較低水平上，如酶濃度4%～6%中，蛋白脫除率的增加已趨于平緩，在6%的酶濃度時(shí)為76.4%；木瓜蛋白酶法脫蛋白中多糖保留率隨著酶濃度的增加，多糖保留率逐步下降，但下降幅度并不大，整體保持在較高水平上（93.32%～85.70%）。綜合兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，在木瓜蛋白酶濃度為6%時(shí)，整體脫蛋白效果較好，此時(shí)蛋白脫除率為76.4%，多糖保留率為85.7%。

圖3 木瓜蛋白酶濃度對(duì)桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

2.4 鹽酸法脫蛋白

鹽酸法脫蛋白結(jié)果如圖4所示，隨著鹽酸濃度的升高，蛋白脫除率逐漸升高，但整體水平并不高，鹽酸濃度為0.6 mol·L-1時(shí)，蛋白脫除率為77.3%；多糖保留率隨著鹽酸濃度的升高逐漸降低，整體的多糖保留率水平較低（76.67%～60.17%）。綜合兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，鹽酸濃度為0.3 mol·L-1時(shí)，桃膠多糖脫蛋白效果較好，此時(shí)蛋白脫除率為70.04%，多糖保留率為74.12%。

圖4 鹽酸濃度對(duì)桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

3 結(jié)論與討論

原桃膠經(jīng)過(guò)精制后可得商品桃膠，其溶解度提高，黏度降低，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。桃膠主要成分為多糖，包括半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖等，脫蛋白是提高桃膠多糖純度和品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。常見的脫蛋白方法包括鹽析法、Sevage法、TCA法、酶法、鹽酸法等，研究表明不同材料所適用的最佳脫蛋白方法并不相同。例如，李小蓉等比較了Sevage法和TCA法對(duì)倒卵葉五加多糖的脫蛋白效果，結(jié)果表明TCA用量為7.5%，TCA處理3次，處理時(shí)間為30 min時(shí)，脫蛋白效果最佳[8]；劉佳維等比較了Sevage法、TCA法和木瓜蛋白酶法對(duì)紅參多糖脫蛋白工藝的效果，結(jié)果表明木瓜蛋白酶法效果最好，最佳工藝為酶用量3%，pH值6，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間2 h[12]；張帥等比較了Sevage法、TCA法、酶法和醋酸鉛法對(duì)筍殼多糖的脫蛋白效果，結(jié)果表明筍殼多糖脫蛋白最佳方法為醋酸鉛法[13]。此外，也有研究將不同脫蛋白方法聯(lián)合使用，例如，王曉林等分別使用了Sevage法、TCA法、酶法、酶法+Sevage法聯(lián)用和酶法+TCA法聯(lián)用分析猴腿蹄蓋蕨多糖的脫蛋白效果，結(jié)果表明酶法+TCA法聯(lián)用的脫蛋白效果最佳[14]。但是不同材料中聯(lián)合使用不同方法的效果也存在很大差別，并不是聯(lián)合使用效果就會(huì)更好，例如，胡會(huì)剛等在研究芒果皮渣多糖脫蛋白工藝時(shí)，除了單獨(dú)使用一種脫蛋白方法外，還使用了TCA+Sevage法、木瓜蛋白酶+TCA法、木瓜蛋白酶+Sevage法、木瓜蛋白酶+TCA-正丁醇法，結(jié)果表明單獨(dú)使用TCA-正丁醇法效果最佳[9]。此外，聯(lián)合使用不同方法存在步驟繁瑣、多糖損失率高等缺點(diǎn)，因此實(shí)際生產(chǎn)中更多使用單一方法。

本研究以蛋白脫除率和多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較了常用的脫蛋白方法對(duì)桃膠多糖的脫蛋白效果。綜合比較幾種脫蛋白方法，Sevage法隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白脫除率迅速提高，在脫蛋白4次時(shí)效果最佳；TCA法當(dāng)TCA濃度為6%時(shí)脫蛋白效果較好，當(dāng)TCA濃度過(guò)高時(shí)多糖保留率下降明顯；木瓜蛋白酶法條件較為溫和，多糖保留率水平是幾種方法中最高的，但是蛋白脫除率水平較低；鹽酸法多糖保留率低于其他方法，可能是因?yàn)樵诖诉^(guò)程中糖苷鍵發(fā)生裂解。綜合比較幾種方法的蛋白脫除率和多糖保留率，Sevage法為桃膠多糖脫蛋白的最佳方法，當(dāng)脫蛋白4次時(shí)，蛋白脫除率為89.64%，多糖保留率為82.47%。