◎ 楊春敏，王燕云，黃建初

（廣州工商學(xué)院，廣東 廣州 510850）

九月黃，別名預(yù)知子、木通子等，是一種野生藤本水果[1]，味道鮮美，甘甜可口，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，富含糖、黃酮、維生素C及多種氨基酸[2]。乳酸菌是一類能以糖為原料的益生菌，發(fā)酵產(chǎn)品具有抗氧化、改善機體免疫力、促進(jìn)機體生長發(fā)育等功效[3]，乳酸菌發(fā)酵還能有效提高產(chǎn)品風(fēng)味、營養(yǎng)價值和貨架期[4]。

九月黃果實鮮甜味美，口味獨特，是一種較理想的乳酸菌發(fā)酵原料，但是目前關(guān)于乳酸菌發(fā)酵九月黃的產(chǎn)品鮮有報道。本文以九月黃為原料，采用植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌組成的復(fù)合菌種對九月黃進(jìn)行發(fā)酵，并對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為開發(fā)九月黃乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九月黃為市售，產(chǎn)自福建省龍巖市；植物乳桿菌JYLP-002、嗜熱鏈球菌JYST-26，山東中科嘉億生物工程有限公司生產(chǎn)。蔗糖為市售，產(chǎn)自浙江省；MRS肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

JY2002電子天平（上海衡平儀器儀表廠）、FP3010榨汁機（德國博朗公司）、TL-08X無菌均質(zhì)機（江蘇天翎儀器有限公司）、YX-24HDD型手提式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、TGL-16MS臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、移液槍（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份有限公司）、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、BMJ-160型霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、TD-35數(shù)顯折光儀（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）、PHS-3C pH計（儀電科學(xué)儀器）、V-1000型可見分光光度計（翱藝儀器（上海）有限公司）及BCD-318WTPZM（E）美的冰箱（合肥美的電冰箱有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

九月黃發(fā)酵飲料工藝流程：九月黃→去皮→加水榨汁打漿（九月黃果肉∶水=1∶3，質(zhì)量比）→過濾、去籽→榨汁→均質(zhì)→添加蔗糖→高壓蒸汽滅菌→接種→發(fā)酵→成品。

1.3.2 操作要點

（1）原料選擇。選用健康、新鮮的九月黃。

（2）榨汁、均質(zhì)。將九月黃洗凈后剝皮，加水榨汁打漿（九月黃果肉∶水=1∶3，質(zhì)量比），經(jīng)無菌紗布過濾后進(jìn)行無菌均質(zhì)。

（3）滅菌。將分裝在三角瓶中九月黃果漿放入高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌。

（4）乳酸菌保藏發(fā)酵劑的選擇。先將兩種乳酸菌的保藏發(fā)酵劑分別放入MRS肉湯中，然后置于MRS肉湯（30 ℃，靜止）中恒溫培養(yǎng)24 h。

（5）九月黃果漿乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)。果漿經(jīng)過滅菌，冷卻后，置于一個無菌的操作平臺上。然后將乳酸菌體中的發(fā)酵劑（菌體濃度：8.0～9.0 lgCFU·mL-1），在6 000 r·min-1的溫度條件下對其進(jìn)行10 min的離心處理后舍棄一次上清液，然后再加入滅好菌的生理鹽水，使乳酸菌體重懸。將重懸的乳酸菌體接入已經(jīng)滅好菌的九月黃果漿中，置于37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵九月黃單因素實驗

單因素實驗的因素固定水平為：發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度37 ℃、蔗糖添加量5%、菌株接種量5%及菌株接種體積比（嗜熱鏈球菌∶植物乳桿菌）1∶1，在固定水平的單因素實驗中每次只改變一個因素的水平值，探究蔗糖添加量（3%、5%、7%、9%）、發(fā)酵溫度（35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、菌株接種量（1.5%、2.0%、2.5%、3%）、發(fā)酵時間（24 h、48 h、72 h、96 h）對九月黃乳酸菌發(fā)酵飲品的活菌數(shù)、pH值和可溶性固形物的影響。

1.3.4 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵九月黃正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取蔗糖添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、菌株接種量（C）和發(fā)酵時間（D）4個因素采用正交表L9（34）進(jìn)行正交優(yōu)化實驗，考察其對復(fù)合乳酸菌活菌數(shù)的影響，確定九月黃乳酸菌發(fā)酵飲品的最佳發(fā)酵工藝條件。正交實驗因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.3.5 指標(biāo)測定

pH值的測定：本實驗通過pH計直接測定，平行測3次取平均值確定pH值。

可溶性固形物的測定：本實驗參照NY/T 2637—2014[5]法執(zhí)行，采用TD-35數(shù)顯折光儀檢測可溶性固形物的含量，在室溫下測定3次取平均值。

乳酸菌活菌數(shù)的測定：本實驗采用固體MRS培養(yǎng)基稀釋平板活菌計數(shù)法，稀釋至10-7后涂板檢測[6]對乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行測定。根據(jù)GB 4789.35—2016對樣品乳酸菌總數(shù)進(jìn)行檢測。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理、極差分析以及圖表制作均通過Microsoft Office Excel 2010軟件完成。

2 結(jié)果與分析

乳酸菌在不同的發(fā)酵因素下產(chǎn)酸能力不同，故可以根據(jù)發(fā)酵后發(fā)酵基質(zhì)的pH值判斷菌種的生長情況，pH值越低，說明產(chǎn)酸能力越強。乳酸菌的活菌數(shù)是對乳酸菌生長情況最直接的描述?？扇苄怨绦挝镏饕▎翁恰㈦p糖和多糖等可溶性糖類，通過測定發(fā)酵過程中可溶性固形物的變化可以判斷微生物利用糖的情況。因而選用pH值、活菌數(shù)和可溶性固形物這3個指標(biāo)判定乳酸菌在九月黃發(fā)酵液中的生長情況。

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 蔗糖添加量對pH值、活菌數(shù)和可溶性固形物的影響

從圖1和圖2可知，隨著蔗糖添加量的增加，乳酸菌的活菌數(shù)先下降再上升，最后趨于穩(wěn)定。在蔗糖添加量為7%～9%的范圍內(nèi)，活菌數(shù)的變化波動較小，在蔗糖添加量為3%時活菌數(shù)最多。嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌均能利用蔗糖作為碳源。但在氮源含量不變的情況下，單方面提高蔗糖添加量容易造成基質(zhì)中的碳氮比失衡，從而導(dǎo)致乳酸菌提早衰亡；此外蔗糖含量過高會造成高滲透壓環(huán)境，對乳酸菌有一定的脫水作用，可抑制其生長[7]。由于蔗糖也屬于可溶性性固形物，所以蔗糖添加量在9%時可溶性固形物達(dá)到的最大值。在此條件下，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵九月黃的適宜蔗糖添加量為3%。

圖1 蔗糖添加量對九月黃發(fā)酵液的pH值、活菌數(shù)的影響圖

圖2 蔗糖添加量對九月黃發(fā)酵液的可溶性固形物的影響圖

2.1.2 發(fā)酵溫度對pH值、活菌數(shù)和可溶性固形物的影響

過低或過高的溫度都會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶活下降，影響產(chǎn)酸能力和發(fā)酵速度，不利于乳酸菌的生長。從圖3中可以看出，發(fā)酵溫度對活菌數(shù)的影響較大，在35～39℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，活菌數(shù)呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，在39 ℃時活菌數(shù)達(dá)到峰值，此時pH值也最低。從圖4可以看出在39 ℃條件下可溶性固形物含量也呈現(xiàn)出最大值。嗜熱鏈球菌屬于嗜熱型微生物，細(xì)胞內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)具有較強的抗熱性，能在50 ℃以內(nèi)的溫度下生長；但植物乳桿菌屬于嗜溫微生物，溫度高于40 ℃，細(xì)胞內(nèi)酶的催化能力會大大降低，甚至?xí)?dǎo)致其喪催化活性，從而影響菌株的正常生長[8]。因此，本實驗選擇39 ℃作為適宜發(fā)酵溫度。

2.1.3 菌株接種量對pH值、活菌數(shù)和可溶性固形物的影響

菌株進(jìn)入對數(shù)生長期的速度和菌株的生長周期會受菌株接種量的影響。從圖5中可以看出，在菌株接種量增加的過程中，乳酸菌的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)接種量為2%時，活菌數(shù)達(dá)到大值14.945 lgCFU·mL-1，此時的pH值為3.78。在菌株接種量較低的條件下，乳酸菌繁殖基數(shù)小，活菌數(shù)增長比較慢。從圖6可知，在接種量為2.0%時可溶性固形物含量達(dá)最高值為12%，而加大接種量則能有效縮短延滯期，也能使九月黃漿液中的營養(yǎng)物質(zhì)被充分利用；但九月黃發(fā)酵液所能提供的營養(yǎng)物質(zhì)又是有限的，接種量過大會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)被過快消耗，同時產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致部分乳酸菌缺乏生長所需的能量，生長受到限制并提早進(jìn)入衰亡期[9]，所以可溶性固形物的含量會隨著菌株接種量的增加而隨之減少。綜合考慮，本實驗選擇2.0%作為復(fù)合乳酸菌發(fā)酵九月黃的適宜菌株接種量。

2.1.4 發(fā)酵時間對pH值和活菌數(shù)的影響

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸量及發(fā)酵的完全程度[10]受發(fā)酵時間影響。在發(fā)酵過程中，乳酸菌利用九月黃漿液中的糖作為碳源，在對數(shù)生長期內(nèi)快速增長，同時產(chǎn)生大量有機酸。當(dāng)有機酸積累到一定程度后，乳酸菌活力下降，同時基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，營養(yǎng)物比例逐漸失衡，使得其走向衰亡期。從圖7中可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)先增加后減少，而pH值則呈現(xiàn)持續(xù)降低趨勢。發(fā)酵72 h后活菌數(shù)值達(dá)到最高為32.930 lgCFU·mL-1。從圖8中可以看到隨著發(fā)酵時間的延長，可溶性固形物的含量整體上呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是九月黃發(fā)酵液中的可溶性物質(zhì)在乳酸菌發(fā)酵過程中被水解利用。在發(fā)酵72 h之后乳酸菌的活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，而可溶性固形物含量的變化也同樣趨于穩(wěn)定，這說明乳酸菌活菌數(shù)的增加與可溶性固形物的減少密切相關(guān)，同時證明乳酸菌可以利用九月黃可溶性固性物作為其營養(yǎng)物質(zhì)。綜合考慮，本實驗確定復(fù)合乳酸菌發(fā)酵九月黃的適合發(fā)酵時間為72 h。

圖3 發(fā)酵溫度對九月黃發(fā)酵液的pH值、活菌數(shù)的影響圖

圖4 發(fā)酵溫度對九月黃發(fā)酵液的可溶性固形物的影響圖

圖5 菌株接種量對九月黃發(fā)酵液的pH值、活菌數(shù)的影響圖

圖6 菌株接種量對九月黃發(fā)酵液的可溶性固形物的影響圖

圖7 發(fā)酵時間對九月黃發(fā)酵液的pH值、活菌數(shù)的影響圖

圖8 發(fā)酵時間對九月黃發(fā)酵液的可溶性固形物的影響圖

2.2 正交實驗結(jié)果與分析

各因素水平的改變對實驗結(jié)果的影響程度取決于極差值的大小，若極差值越大，說明該因素對乳酸菌發(fā)酵果蔬汁的影響就越大。通過對正交實驗表的極差值分析，由表2中正交實驗結(jié)果可知，4個因素的極差值大小排序為：RD＞RA＞RC＞RB，即4各因素對九月黃乳酸菌發(fā)酵飲品發(fā)酵體系中活菌數(shù)的影響大小排序為：發(fā)酵時間＞蔗糖添加量＞菌株接種量＞發(fā)酵溫度。正交實驗結(jié)果和分析k值可知，當(dāng)蔗糖添加量為3%、發(fā)酵溫度為39 ℃、菌株接種量為2.0%、發(fā)酵時間為72 h時的活菌數(shù)達(dá)到最多為20.072 lgCFU·mL-1，即得到最優(yōu)發(fā)酵工藝方案為A1B2C2D2。歐陽佳等[10]選擇嗜熱鏈球菌和其他植物乳桿菌兩種菌作為復(fù)合發(fā)酵菌種，發(fā)酵淮山，在菌株接種量、蔗糖添加量分別為5%、3%，嗜熱鏈球菌∶其他植物乳桿菌體積比為1∶1、發(fā)酵持續(xù)時間為16 h、發(fā)酵溫度為40 ℃條件下的活菌數(shù)均可達(dá)到8.62 lgCFU·mL-1本實驗取得了與之相近的研究結(jié)果。

表2 發(fā)酵工藝參數(shù)正交實驗方案和實驗結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究以野果九月黃為單一原料，采用嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌的混合菌發(fā)酵九月黃漿液制成乳酸菌飲料，以pH值、乳酸菌活菌數(shù)和可溶性固形物含量作為評價指標(biāo)，通過單因素實驗和正交實驗確定了九月黃乳酸菌發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝為蔗糖添加量3%、菌種接種量2.0%、發(fā)酵時間72 h、發(fā)酵溫度39 ℃，活菌數(shù)超過20.072 lgCFU·mL-1。同時，發(fā)酵過程中可溶性固形物含量的變化表明乳酸菌能利用九月黃中的可溶性固形物。此研究所用原料豐富、風(fēng)味獨特、制備工藝簡單，為九月黃乳酸菌發(fā)酵飲料的生產(chǎn)和加工提供了一定的理論基礎(chǔ)和實驗支撐，也進(jìn)一步豐富了九月黃產(chǎn)品的種類。