焦海山,宋悅寧,肖 波,黃 健,李東印

(1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室, 江蘇蘇州 215009; 2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)教研室,江蘇蘇州 215009)

周圍神經(jīng)損傷在臨床上較為常見,按治療原則應(yīng)盡早恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性,但由于臨床損傷的復(fù)雜性,受各種主觀、客觀條件影響,在急性期未得到及時處理而演變?yōu)殛惻f性損傷的病例仍較多。 相對于急性神經(jīng)損傷,陳舊性神經(jīng)損傷中近端神經(jīng)元的成活率,遠端維持再生神經(jīng)生長的微環(huán)境等條件皆較差,尤其是失神經(jīng)支配的遠側(cè)斷端和靶器官的等待時間將比急性損傷直接修復(fù)長,導(dǎo)致陳舊性神經(jīng)損傷修復(fù)效果較差[1-4]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雌性SPF 級SD 大鼠30 只由中科院上海實驗動物中心提供[SCXK(滬)2017-0005],7 周齡,體重160～180 g 左右,隨機分為缺損8 周自體神經(jīng)修復(fù)+SLES 組(實驗組,n=15),缺損8 周自體神經(jīng)修復(fù)組(對照組,n=15)。 動物實驗在蘇州大學(xué)實驗動物中心完成[SYXK(蘇)2016-0049]。 動物實驗研究由蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院實驗動物倫理委員會審查并批準(SWAE202002),動物實驗過程遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠抗生長相關(guān)蛋白-43 (growth-associated proteins 43,GAP-43)單抗、兔抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)多抗、羊抗小鼠 IgG-FITC 二抗、羊抗兔 IgG-TRITC 二抗、小鼠抗神經(jīng)絲蛋白(neurofilament, NF)單抗、兔抗可溶性蛋白-100(soluble protein-100, s-100)多抗(以上抗體皆來自武漢博士德生物工程有限公司);熒光金(Fluoro-Gold,FG)逆行示蹤劑(Fluorochrome 公司, 美國);TI CFIS60 倒置熒光顯微鏡(Nikon 公司,日本);JEM1230 透射電鏡(JEOL 公司,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備、修復(fù)及一般觀察

以含3%的戊巴比妥鈉的復(fù)合麻醉劑(30 mg/kg)對動物進行腹腔注射麻醉,麻醉成功后,選取左側(cè)股中部切口,在無菌條件下切開并鈍性分離暴露左側(cè)坐骨神經(jīng),在股中部位置切除大鼠坐骨神經(jīng)6 mm,神經(jīng)切除后,將近、遠側(cè)斷端神經(jīng)分別翻轉(zhuǎn)180°,以9-0 醫(yī)用錦綸單絲線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)將神經(jīng)斷端分別縫合固定在不同的肌間隙中,避免神經(jīng)自發(fā)再生。 手術(shù)完成后將動物繼續(xù)飼養(yǎng)8 周,同前麻醉、自原切口無菌條件下進入,暴露損傷側(cè)坐骨神經(jīng),修剪近、遠側(cè)神經(jīng)斷端,制成大鼠坐骨神經(jīng)13 mm 缺損延遲8 周修復(fù)的陳舊性神經(jīng)缺損模型。 無菌條件下切取對側(cè)股中部13 mm 長正常坐骨神經(jīng)橋接至左側(cè)坐骨神經(jīng)缺損。實驗組動物在橋接后采用BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)施以SLES 處理:陰性電極固定在近側(cè)端神經(jīng)干上,陽性電極固定于神經(jīng)附近的骨骼肌上,予以1 h 的低頻(20 Hz)方波電刺激(3 V, 0.1 ms),對照組橋接后同前放置電極,但不予刺激。 手術(shù)完成后縫閉切口,除用于觀察神經(jīng)元相關(guān)因子表達情況的動物外,皆繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)3個月取材。

1.3.2 取材觀察

(1)神經(jīng)元中相關(guān)因子表達觀察

諾貝麗斯（Novelis）是全球領(lǐng)先的鋁壓延產(chǎn)品制造商，以及全球最大的鋁回收利用公司。諾貝麗斯的運營覆蓋全球10個國家，擁有約11 000名員工，其2017財年的收入約為100億美元。諾貝麗斯為北美洲、歐洲、亞洲和南美洲的運輸、包裝、建筑、工業(yè)和消費電子市場提供優(yōu)質(zhì)鋁板和鋁箔產(chǎn)品。諾貝麗斯是鋁和銅領(lǐng)域全球領(lǐng)導(dǎo)者印度鋁工業(yè)有限公司（Hindalco Industries Limited）的子公司。

隨機選取實驗組、對照組修復(fù)術(shù)后1、2、7 d 的實驗動物各2 只,同前麻醉后,經(jīng)心臟灌注,取脊髓L4—L5 節(jié)段以及相應(yīng)的背根節(jié),經(jīng)4%多聚甲醛后固定等處理后,冰凍切片,作抗GAP-43、BDNF 免疫熒光組織化學(xué)染色,(一抗:小鼠抗GAP-43 單抗,1 ∶300;兔抗 BDNF 多抗,1 ∶200;二抗:羊抗小鼠 IgG-FITC,1 ∶250;羊抗兔 IgG-TRITC,1 ∶250),TI CFIS60熒光顯微鏡觀察并記錄圖像。

(2)熒光金逆行示蹤實驗

動物第2 次手術(shù)后3 個月,隨機選取實驗組和對照組3 只動物,同前麻醉后,在遠側(cè)吻合口以遠5 mm 處使用微量進樣針給每只動物注射5%FG 逆行示蹤劑10 μL,動物注射示蹤劑后繼續(xù)飼養(yǎng)1 周取材,選取脊髓腰膨大段(L4—L5)以及相應(yīng)的背根節(jié),常規(guī)后固定等處理后冰凍切片,熒光顯微鏡觀察并記錄圖像。 使用Abercrombie 等[11]報道的方法計數(shù)FG 標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量。

(3)神經(jīng)肌肉形態(tài)學(xué)觀察和計量

剩余動物第2 次手術(shù)后3 個月取材,同前麻醉,切取實驗側(cè)腓腸肌,稱重并計算相對濕重比(術(shù)側(cè)腓腸肌重量/體重×100%),常規(guī)后固定梯度蔗糖沉底后冰凍切片,作Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組化染色,顯微鏡觀察并記錄圖像。

切取橋接物及兩端相連的神經(jīng),每組隨機選取3 只,切取遠端吻合口以遠5 mm 處神經(jīng)作電鏡標(biāo)本處理,常規(guī)鈾-鉛染色,JEM1230 透射電鏡觀察。 圖像分析系統(tǒng)進行圖像處理,計算有髓神經(jīng)纖維軸突直徑及髓鞘厚度等指標(biāo)。

其余3 只選取橋接物中段作冰凍切片,分別作神經(jīng)三色染色和抗NF、S-100 免疫熒光組織化學(xué)染色(一抗:小鼠抗 NF 單抗,1 ∶400;兔抗 S-100 多抗,1 ∶200;二抗:羊抗小鼠 IgG-FITC,1 ∶250;羊抗兔 IgGTRITC,1 ∶250),熒光顯微鏡觀察并采圖。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元中相關(guān)因子表達觀察

實驗組脊髓運動神經(jīng)元(圖1)和背根節(jié)(圖2)感覺神經(jīng)元GAP-43 和BDNF 的表達在修復(fù)后1 ～2 d 增加,7 d 后逐漸下降。 而對照組修復(fù)術(shù)后 1、2、7 d,兩種因子的表達上調(diào)較為緩慢,在第1、2 天幾乎難以觀察到因子表達,遲至第7 天才觀察到少量神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)GAP43 和BDNF 的表達。

2.2 熒光金逆行示蹤結(jié)果

實驗組與對照組動物術(shù)側(cè)脊髓灰質(zhì)前角及相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)中皆觀察到被FG 逆行標(biāo)記的神經(jīng)元胞體(圖3),但實驗組與對照組中被FG 標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量則未觀察到明顯差別(表1)。

2.3 再生神經(jīng)形態(tài)觀察

2.3.1 再生神經(jīng)大體觀察

兩組再生神經(jīng)與近遠側(cè)端神經(jīng)連接良好,連接處無明顯膨大、腫脹,無粘連,表面血管生長清晰可見。

2.3.2 光鏡觀察

兩組中段神經(jīng)組織橫切面三色染色(髓鞘染成紅色,軸突染成藍綠色)和縱切面抗NF 與S-100 雙重免疫熒光組織化學(xué)染色(髓鞘成紅色熒光,軸突為綠色熒光)的切片上皆觀察到發(fā)育良好的再生神經(jīng)組織(圖4、5),有髓神經(jīng)纖維分布均勻,三色染色片中神經(jīng)纖維間皆可見少量增生結(jié)締組織,兩種染色片中實驗組相對于對照組皆未觀察到明顯優(yōu)勢,當(dāng)然與正常神經(jīng)相比,無論是髓鞘發(fā)育程度還是神經(jīng)纖維密度等皆差異明顯。

2.3.3 電鏡觀察

實驗組與對照組遠端神經(jīng)電鏡圖片(圖6)上,可見較多的有髓神經(jīng)纖維,髓鞘結(jié)構(gòu)致密均勻,板層結(jié)構(gòu)清晰,再生神經(jīng)纖維成簇分布。 形態(tài)學(xué)統(tǒng)計分析顯示(表1),髓鞘厚度及神經(jīng)纖維密度兩項指標(biāo)實驗組雖略高于對照組,但未見明顯組間差別(P值分別為0.767,0.908),軸突直徑和G 比值兩項指標(biāo)對照組略高于實驗組,但組間差異亦不明顯(P值分別為0.960,0.565)

2.4 腓腸肌形態(tài)觀察與計量

2.4.1 腓腸肌大體觀

整個實驗過程中,隨時間的延長,缺損神經(jīng)對應(yīng)的靶肌肉萎縮情況逐漸加重。 橋接修復(fù)時觀察到兩組動物術(shù)側(cè)腓腸肌較相應(yīng)的非手術(shù)側(cè)均有不同程度的萎縮。 取材時發(fā)現(xiàn),兩組動物術(shù)側(cè)靶肌肉萎縮明顯,肉眼觀與對照組類似。

2.4.2 相對濕重比

實驗組術(shù)側(cè)腓腸肌相對濕重比略高于對照組(表1),但組間差異亦不明顯(P=0.760)。

2.4.3 光鏡觀察

在兩組動物實驗側(cè)腓腸肌Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組化染色切片上(圖7),皆觀察到一定數(shù)量的運動終板,呈類圓形或橢圓形、深棕色,肌纖維橫紋清晰,可見有未著色的運動神經(jīng)纖維(研究中曾采用鍍銀復(fù)染證實其為神經(jīng)纖維)與運動終板相連。

圖1 神經(jīng)缺損8 周修復(fù)術(shù)后不同時間段脊髓橫切面抗GAP43 和BDNF 雙重免疫熒光組織化學(xué)染色Note. Staining for GAP43 (A1-F1,green) and BDNF (A2-F2,red) (merged in A3-F3) in the experimental group (A1-A3、C1-C3、E1-E3) or control group(B1-B3、D1-D3、F1-F3) at 1,2, 7 days after repair, respectively. The same as below.Figure 1 Light micrographs following double staining for GAP43 and BDNF on the transversely sectioned spinal cord after repair of the 8-week-delayed defective nerve

3 討論

周圍神經(jīng)缺損再生是世界性難題,陳舊性周圍神經(jīng)再生修復(fù)更是困難。 由于受傳統(tǒng)理論的影響,特別是在學(xué)術(shù)界長期占據(jù)統(tǒng)治地位的“神經(jīng)損傷一年以上無修復(fù)價值”觀念的影響[1-3],致陳舊性周圍神經(jīng)缺損是否有修復(fù)價值一直存在爭論,另一方面,由于神經(jīng)再生速度緩慢,再生神經(jīng)到達靶器官前,肌肉已經(jīng)發(fā)生不可逆性萎縮,特別是對于效應(yīng)器距離損傷部位較遠的外周神經(jīng)高位損傷,即便神經(jīng)再生能夠?qū)崿F(xiàn),但再生的神經(jīng)末梢與萎縮的肌纖維之間也很難重新建立有效的神經(jīng)-肌接頭,從而使神經(jīng)再生的效果大打折扣。 這些客觀現(xiàn)實都在一定程度上形成了臨床工作者在面對陳舊性周圍神經(jīng)缺損治療時的消極心理,甚至放棄積極修復(fù)轉(zhuǎn)而行肌腱轉(zhuǎn)位或肌腱固定等功能重建手術(shù)。

圖2 神經(jīng)缺損8 周修復(fù)術(shù)后不同時間段背根節(jié)橫切面抗GAP43 和BDNF 雙重免疫熒光組織化學(xué)染色Note. A/B, Experimental group. C/D, Control group.Figure 2 Light micrographs following double staining for GAP43 and BDNF on the transversely sectioned DRGs after repair of the 8-week-delayed defective nerve

表1 逆行示蹤、再生神經(jīng)形態(tài)學(xué)、腓腸肌相對濕重定量比較(ˉx±s, n=3)Table 1 Quantitative comparison of the retrograde labeling,morphology of regenerative nerve and the relative wet weight of gastrocnemius muscle

圖3 FG 逆行示蹤脊髓(A、C)和背根節(jié)(B、D)觀察Note. A/B, Experimental group. C/D, Control group.Figure 3 Light micrographs following FluoroGold retrograde tracing of spinal cord (A, C) and DRGs (B, D)

圖4 橋接物中段橫切面神經(jīng)三色染色Note. A, Experimental group. B, Control group. C, Normal nerve.A1-C1, Higher magnifications of the boxed areas in A-C.Figure 4 Light micrographs following Meyer’s modified trichrome staining on transversely sectioned mid-portion of the regenerated segment at the operated side

圖5 橋接物中段橫切面抗NF 與S-100 雙重免疫熒光組織化學(xué)染色Note. A1-A3,Experimental group. B1-B3, Control group. C1-C3,Normal nerve. A1-C1, Staining for NF. A2-C2, S-100. A3-C3,merged.Figure 5 Light micrographs following double staining for NF and S-100 on the transversely sectioned mid-portion of the regenerated segment

圖6 術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)遠端電鏡觀察Note. A, Experimental group. B, Control group. A1, Higher magnifications of the boxed areas in A.Figure 6 Transmission electron micrographs of distal sciatic nerve portion at the operated side

對周圍神經(jīng)損傷再生過程而言,其難度主要包括:近端神經(jīng)元再生率低;軸突再生速度慢,再生距離長;遠端再生微環(huán)境逐漸退變,難以維持“漫長”的再生時間等[12],對陳舊性神經(jīng)損傷,遠端靶器官所經(jīng)歷的長時間等待就更長了。 因此,能促使上述神經(jīng)再生過程有些許縮短的因素都將對提高陳舊性神經(jīng)損傷的再生效果提供幫助。

圖7 術(shù)側(cè)腓腸肌Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組化染色光鏡觀察Note. A, Experimental group. B, Control group. C, Normal nerve.A1-C1, Higher magnifications of the boxed areas in A-C.Figure 7 Light micrographs following Karnovsky-Root cholinesterase staining of the motor endplate on transverse sections of gastrocnemius muscle at the operated side

外周神經(jīng)損傷后,遠側(cè)端的再生微環(huán)境對再生軸突的支持作用固然重要,但由于來自遠側(cè)端施萬細胞所提供的GDNF、BDNF 等營養(yǎng)因子表達較慢且難以在早期對軸突再生提供有效支持,對陳舊性神經(jīng)損傷來說,這種支持顯然大為降低,因此來自近端神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子顯得尤為關(guān)鍵,其表達水平與時效性在促進神經(jīng)再生中發(fā)揮著重要作用。

文獻報道顯示低頻電刺激可能是通過激活神經(jīng)元胞體上的電壓依從性鈣通道(這種短期電刺激對神經(jīng)再生的作用可被鈉通道阻滯劑TTX 阻斷構(gòu)成了這一推斷的間接證據(jù)),進而激活胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶/cAMP-依賴性蛋白激酶系統(tǒng)[13-14],促使胞體內(nèi)cAMP 水平上升,激活下游的PKA、CREB,進而啟動 BDNF、trkB、Tα1-tubulin 及 GAP-43 等系列內(nèi)源性因子的表達,促進神經(jīng)軸突早期再生,并幫助再生的軸突通過損傷點進入遠端,縮短整體再生時間[7,15-19]。 上述通過影響近端神經(jīng)元發(fā)揮促神經(jīng)再生作用的可能機制也被認為是電刺激促神經(jīng)再生的主要途徑。 本實驗觀察了橋接修復(fù)早期動物相應(yīng)神經(jīng)元內(nèi)源性神經(jīng)因子的表達,觀察到SELS對神經(jīng)元內(nèi)源性因子表達的促進作用,與前述文獻報道基本一致。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干切斷后1 個月時,近端脊髓前角中神經(jīng)元數(shù)量丟失最多,減至對照側(cè)60%,神經(jīng)元胞體則經(jīng)歷先腫脹后縮小的變化,至2 ～3 個月左右,神經(jīng)元胞體形態(tài)趨于穩(wěn)定,以后形態(tài)、數(shù)量變化不大,直到12 個月[20-21]。 損傷側(cè)近端脊髓中神經(jīng)元的這些形態(tài)、數(shù)量的變化較大程度上影響了陳舊性神經(jīng)缺損模型近端神經(jīng)元對SLES 的響應(yīng)速度和相關(guān)因子的上調(diào)水平,從而影響了SLES 對陳舊性損傷的周圍神經(jīng)再生的促進作用。

Han 等[22]、Xu 等[23]的研究認為電刺激能對延遲修復(fù)的陳舊性神經(jīng)損傷發(fā)揮促神經(jīng)再生作用,但延遲期超過1 個月的神經(jīng)損傷,電刺激發(fā)揮的促神經(jīng)再生作用則較為有限。 Huang 等[24]最近的研究指出,電刺激可以促進陳舊性神經(jīng)缺損的神經(jīng)再生,最長延遲期可達24 周。 這可能與實驗中使用的神經(jīng)缺損模型不同有關(guān)。 本研究所制備的陳舊性周圍神經(jīng)缺損模型為無自發(fā)再生可能的長距離神經(jīng)缺損(對大鼠而言,＞12 mm 被認為是長距離神經(jīng)缺損[25-26]),缺損距離長達13 mm, 比Huang 等[24]研究中的 5 mm 神經(jīng)缺損模型距離長。 Elzinga等[27]使用交叉縫合模型來研究電刺激對陳舊性神經(jīng)損傷的作用,發(fā)現(xiàn)電刺激對延遲達3 個月的陳舊性神經(jīng)損傷仍然有促進作用。 交叉縫合模型采用的是無缺損的直接端對端吻合,與本研究所用的長距離神經(jīng)缺損模型相比,神經(jīng)損傷程度、神經(jīng)修復(fù)和再生的難度皆有較大區(qū)別。 但 Huang 等[24]、Elzinga 等[27]的研究是有價值的,顯示了電刺激對陳舊性神經(jīng)損傷修復(fù)的積極作用。

綜上所述,在本研究中,我們雖然在實驗組中觀察到SLES 對神經(jīng)元相關(guān)神經(jīng)因子表達的一定促進作用,但在神經(jīng)纖維發(fā)育、靶器官再支配和肌肉宏觀相對濕重比等方面,實驗組動物均未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。 這些結(jié)果表明,SLES 對延遲至8 周修復(fù)的陳舊性坐骨神經(jīng)損傷的積極作用難以抵消延遲時間延長導(dǎo)致殘存神經(jīng)元再生率下降、遠端再生微環(huán)境支持能力減弱、靶肌萎縮等不利因素。 因此,對于陳舊性周圍神經(jīng)損傷,有必要進一步優(yōu)化電刺激的方式,比如術(shù)中直接刺激與術(shù)后的體外刺激相結(jié)合,刺激近端神經(jīng)元與激活遠端再生微環(huán)境、保護靶器官相結(jié)合,多措并舉,使電刺激更好的發(fā)揮對陳舊性周圍神經(jīng)再生的促進作用。