任良強(qiáng),侯曉曉,喬 平,王 圣,廖 旺,李 斌

(海南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科, 海口 570311)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心內(nèi)科常見危急重癥,指冠狀動脈狹窄或阻塞引起的急性、持續(xù)性、缺血缺氧性心肌病,臨床主要表現(xiàn)為心率失常、持久而劇烈的胸骨后疼痛、急性循環(huán)功能障礙和發(fā)熱等,最終導(dǎo)致心力衰竭,誘發(fā)死亡[1]。 AMI 臨床治療以開通梗死相關(guān)血管,挽救瀕死心肌為基本原則,主要通過藥物溶栓及經(jīng)冠狀動脈介入治療等方法進(jìn)行治療,但由于手術(shù)治療的危險(xiǎn)性以及術(shù)后血管再狹窄等問題限制了其在治療AMI 中的應(yīng)用[2]。 近年來,隨著血管新生療法理念的提出,使干細(xì)胞移植治療AMI 得到廣泛研究,尤其是人臍血單個(gè)核細(xì)胞(human cord blood mononuclear cells,HCMNCs)在卵巢早衰等多種疾病的移植治療中取得一定效果[3]。 HCMNCs 取材方便、免疫原性低、移植耐受性好,富含造血干細(xì)胞、內(nèi)皮組細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等,是干細(xì)胞移植的重要來源[4]。 既往研究顯示,HCMNCs 參與調(diào)節(jié)腦內(nèi)血管生成過程,并參與心肌梗死后缺血性心肌保護(hù),對缺血性心腦血管病表現(xiàn)出一定的治療作用,然而其作用機(jī)制尚不清楚[5-6]。 本研究通過觀察HCMNCs 對AMI 大鼠血管新生的促進(jìn)作用,旨在探討其治療AMI 的作用機(jī)制,為臨床治療AMI 提供新的治療方法和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性健康 Wistar 大鼠 35 只,7 ～ 8 周齡,體重(250±20)g,由北京維通利華公司提供[SCXK(京)2016-0001]。 大鼠購入后飼養(yǎng)于海南省藥物安全性評價(jià)研究中心實(shí)驗(yàn)動物房[SYXK(瓊)2016-0013],保持溫度(20±2)℃,相對濕度(55±5)%,12 h/12 h 明暗交替,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。 本研究經(jīng)海南省 人 民 醫(yī) 院 倫 理 委 員 會 審 核 通 過(2018004160039)。 研究過程遵循 3R 原則,給予動物人道主義關(guān)懷。

1.1.2 臍血來源

臍血來源于本院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦順產(chǎn)后新生兒臍帶靜脈血,收集100 mL,置于含有抗凝劑的收集袋中。 所有產(chǎn)婦均無妊娠并發(fā)癥,均不攜帶乙肝、艾滋、梅毒等病毒,無遺傳性疾病家族史和血液系統(tǒng)疾病史,無急性炎癥和自身免疫性疾病。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過,征求供者同意,并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

6%羥乙基淀粉(美國 Hospira 公司);小鼠抗BrdU 單抗(美國 Neomarkers 公司);二抗:即用型免疫組化廣譜試劑盒、GE Ficoll-paque Plus 淋巴細(xì)胞分離液(北京百奧萊博科技有限公司);兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)多抗、CD31 多抗(美國 Abcam 公司);高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics Inc 公司);小動物呼吸機(jī)(美國哈佛儀器公司);多導(dǎo)生理信號記錄儀(美國BIOPAC 公司);M10125 型PCR儀、Experion 型電泳儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HCMNCs 的分離、標(biāo)記及活性檢測

取臍血和6%羥乙基淀粉按5 ∶1比例加入50 mL離心管中,靜置45 min,提取上層渾濁層,將提取液按2 ∶1鋪在淋巴細(xì)胞分離液上,2000 r/min(離心半徑10 cm)20℃條件下離心25 min,棄上清,獲得單個(gè)核細(xì)胞。 將分離的HCMNCs 置于含有10 μmol/L的BrdU、10%胎牛血清的L-DMEM 培養(yǎng)基中,于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2,37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h。 錐蟲藍(lán)染液染色,活細(xì)胞不著色,死細(xì)胞被染成藍(lán)色,顯微鏡下觀察活細(xì)胞占比≥98%,可用于移植。

1.3.2 CFSE 標(biāo)記HCMNCs

取 CSFE 溶液(2.5 μmol/mL)500 μL,與 4×106個(gè)細(xì)胞混勻,4℃條件下反應(yīng)30 min,熒光顯微鏡下觀察染色率,≥95%,且染色后細(xì)胞活性在90%以上,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 建模、分組及干預(yù)

隨機(jī)選取25 只大鼠,參照文獻(xiàn)[7],采用冠狀動脈結(jié)扎法建立急性心肌梗死大鼠模型。 大鼠按40 mg/kg 體重腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,仰臥固定,連接呼吸機(jī),記錄心電圖,頸部備皮,打開頸部皮膚,進(jìn)行氣管插管;在大鼠左側(cè)胸部,第4 ～5 肋間,切開皮膚,鈍性分離胸肌,暴露心臟,在左心耳根部與肺動脈圓錐交界處下方2 mm 處結(jié)扎冠脈左前降支,觀察大鼠心電圖及心肌顏色的改變,心電圖出現(xiàn)ST 段明顯抬高,左室心肌顏色變白,局部心肌搏動減弱,視為造模成功。 20 只大鼠造模成功,隨機(jī)分為模型組10 只,HCMNCs 組10 只。 剩余10只為假手術(shù)組,操作步驟同上,冠狀動脈只穿線,不結(jié)扎。 建模成功后,HCMNCs 組大鼠在心肌變白與正常心肌交界處取三個(gè)點(diǎn),采用微量注射器注入CSFE 標(biāo)記的 HCMNCs,每點(diǎn)注射 50 μL(約 1×107個(gè)細(xì)胞),假手術(shù)組和模型組同部位注入等量含有10 μmol/L 的 BrdU、10%胎牛血清的 L-DMEM 培養(yǎng)基。

1.3.4 超聲心動圖檢測心功能

細(xì)胞移植4 周后,1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,胸部備皮,仰臥固定后,行M 型超聲心動圖檢測大鼠心功能,探頭頻率為15 MHz,記錄左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension, LVEDd)、 左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic dimension, LVEDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左室短軸縮短率(fraction Shortening, FS),選取3 個(gè)心動周期進(jìn)行監(jiān)測,取平均值。

1.3.5 HE 染色觀察心肌病理變化

超聲完畢后,處死后迅速取心臟,生理鹽水沖洗干凈后,沿房室溝減去左右心房,除去大血管,剪去右心室,沿左心室長軸中間部分一分為二,一部分保存于4%多聚甲醛中固定24 h,經(jīng)梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(片厚約5 μm),常規(guī)HE 染色,于顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.3.6 熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞數(shù)量

取心肌切片,在熒光顯微鏡下觀察視野中綠色熒光面積與心梗面積比例,計(jì)算細(xì)胞局部存活率。

1.3.7 BrdU 染色檢測移植細(xì)胞存活情況

取心肌組織切片,脫蠟至水,3% H2O2室溫孵育10 min,封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,蒸餾水沖洗,抗原修復(fù)后,按照免疫組化試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色,存活細(xì)胞BrdU 染色陽性為深褐色顆粒,顯微鏡下觀察存活細(xì)胞情況。

1.3.8 檢測心肌梗死邊緣微血管密度(microvessel density, MVD)和 CD31、VEGF 蛋白表達(dá)水平

取心肌組織切片,脫蠟至水,3% H2O2室溫孵育10 min,封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,蒸餾水沖洗,按照免疫組化試劑盒說明書,加入1 ∶100 稀釋的CD31、VEGF 一抗,孵育過夜,依次加入試劑1 和試劑2,DAB 顯色,陰性對照以PBS 代替一抗,CD31陽性細(xì)胞呈棕黃色顆粒,顯微鏡下觀察CD31 陽性細(xì)胞表達(dá)情況,計(jì)算單位面積內(nèi)CD31 為陽性的微血管數(shù)目,梗死邊緣隨機(jī)選取5 個(gè)視野,取平均值即為MVD。 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒表示VEGF 蛋白表達(dá)陽性,統(tǒng)計(jì)CD31、VEGF 蛋白陽性表達(dá)光密度值,以光密度值高低代表蛋白陽性表達(dá)率。

1.3.9 Western blot 法檢測心肌組織中 CD31、VEGF 蛋白相對表達(dá)水平

心肌另一部分保存于液氮中,取液氮中保存心肌組織,冰上研磨,提取總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度,采用10%聚丙烯酰胺凝膠分離目的蛋白,蛋白經(jīng)電泳后,轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,洗膜后加入 1 ∶1000 濃度的 CD31、VEGF、β-actin 抗體,4℃孵育過夜,洗膜,加入 1 ∶5000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h,洗膜,加入ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影,曝光成像,采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值,VEGF 蛋白相對表達(dá)水平以其蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能指標(biāo)變化

LVEDs、LVEDd、LVEF、FS 水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 與假手術(shù)組比較,心梗組和 HCMNCs 組 LVEDs、LVEDd 水平升高,LVEF、FS水平降低(P＜0.05);與心梗組比較,HCMNCs 組LVEDs、LVEDd 水平降低,LVEF、FS 水平升高(P＜0.05)。 見表 1。

2.2 心肌組織病理變化

HE 染色顯示,假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊,走向規(guī)律;心梗組心肌細(xì)胞排列紊亂,有大量炎性細(xì)胞浸潤;HCMNCs 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,心肌纖維排列較整齊,仍可見梗死區(qū)域。 見圖1。

2.3 細(xì)胞存活率

熒光顯微鏡下顯示,假手術(shù)組和心梗組均未見綠色熒光,HCMNCs 組CSFE 陽性細(xì)胞,綠色熒光面積占心梗面積(38.59±10.25)%。 見圖2。

2.4 BrdU 標(biāo)記細(xì)胞情況

BrdU 染色顯示,假手術(shù)組和心梗組均未檢測到BrdU 標(biāo)記的陽性細(xì)胞,HCMNCs 組梗死區(qū)可見散在分布的 BrdU 陽性細(xì)胞,參與血管壁的組成。 見圖3。

2.5 免疫組化染色檢測心肌組織CD31 蛋白及MVD 水平

CD31 蛋白及MVD 水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 與假手術(shù)組比較,心梗組和HCMNCs 組CD31 蛋白光密度值和 MVD 減少(P＜0.05);與心梗組比較,HCMNCs 組CD31 蛋白光密度值和 MVD 增加(P＜0.05)。 見表 2,圖 4。

2.6 免疫組化檢測心肌組織中VEGF 蛋白相對表達(dá)水平

假手術(shù)組、心梗組和HCMNCs 組VEGF 蛋白光密值分別為:(116.45±11.62),(76.25±9.16),(93.17±10.24)。 VEGF 蛋白光密值組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.922,P＜0.05)。 與假手術(shù)組比較,心梗組和HCMNCs 組VEGF 蛋白光密值減小(t= 8.592,4.753,P＜0.001);與心梗組比較,HCMNCs 組 VEGF 蛋白光密值增大 (t=3.878,P＜0.001)。 見表 2,圖 5。

2.7 Western blot 法檢測心肌組織中 CD31、VEGF 蛋白相對表達(dá)水平

CD31、VEGF 蛋白相對表達(dá)水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 與假手術(shù)組比較,心梗組和HCMNCs 組CD31、VEGF 蛋白相對表達(dá)水平降低(P＜0.05);與心梗組比較,HCMNCs 組 CD31、VEGF蛋白相對表達(dá)水平升高(P＜0.05)。 見表3,圖6。

3 討論

心肌組織持續(xù)性缺血缺氧發(fā)生AMI,造成局部心肌細(xì)胞變性、壞死,繼而引起心功能下降或喪失,殘存的心肌細(xì)胞負(fù)荷增加,發(fā)生代償性肥厚,導(dǎo)致心室擴(kuò)張,發(fā)生心室重構(gòu),最終發(fā)展為心力衰竭,是AMI 患者死亡的主要原因[8]。 如何促進(jìn)梗死區(qū)心肌內(nèi)血管新生,改善局部血液供應(yīng),恢復(fù)缺血區(qū)再灌注,減小梗死面積,保護(hù)心功能,成為治療AMI 的研究熱點(diǎn)。 隨著HCMNCs 在臨床醫(yī)學(xué)及再生醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用,HCMNCs 移植在腫瘤、免疫缺陷癥以及代謝性疾病等移植治療過程中發(fā)揮重要作用,其可向各種組織細(xì)胞定向分化,通過移植HCMNCs 有望成為治療AMI 的新途徑[9-10]。

HCMNCs 來源充足,所含前體細(xì)胞種類豐富,與成人年組織中的干細(xì)胞相比,其具有更高增殖分化潛能,并且免疫原性極低,機(jī)體免疫系統(tǒng)難以識別,是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)重要的治療工具。 HCMNCs 具有強(qiáng)大的定向分化能力,劉子琳等[11]通過移植HCMNCs治療大鼠腓腸肌失神經(jīng)損傷,Petukhova 等[12]通過HCMNCs 治療阿爾茲海默病小鼠,都取得了一定效果,HCMNCs 可以分別向肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞方向分化,改善組織損傷,發(fā)揮治療作用。 本研究使用BrdU 對 HCMNCs 進(jìn)行標(biāo)記,結(jié)果顯示 HCMNCs 組大鼠心肌梗死邊邊緣分布有BrdU 標(biāo)記陽性的細(xì)胞,表明 HCMNCs 在大鼠體內(nèi)移植成功,并且HCMNCs 組大鼠心功能指標(biāo)及心肌病理變化得到一定改善,提示HCMNCs 對AMI 對大鼠具有改善心功能的作用。 慢性終末期心力衰竭患者采用HCMNCs治療后,心功能得到明顯改善,血管性癡呆患者通過HCMNCs 移植治療后,腦部血流速度加快,認(rèn)知功能提高,表明HCMNCs 對心血管疾病有一定治療作用[13-14]。 本研究結(jié)果與Saha 等[15]在缺血缺氧性腦損傷中的效果一致,提示通過HCMNCs 移植治療AMI 大鼠,可減輕心室擴(kuò)張,具有一定改善心功能的作用。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)(( ), n=10)Table 1 Heart function indexes of rats in each group

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)(( ), n=10)Table 1 Heart function indexes of rats in each group

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與心梗組比較,bP＜0.05。Note. Compared with sham operation group, aP ＜0.05. Compared with myocardial infarction group, bP＜0.05.

組別Groups左室收縮末期內(nèi)徑(mm)LVEDs左室舒張末期內(nèi)徑(mm)LVEDd左室射血分?jǐn)?shù)(%)LVEF左室短軸縮短率(%)FS假手術(shù)組operation group 4.96±0.55 6.03±0.66 71.26±7.14 43.28±4.45心梗組Myocardial infarction group 7.38±0.72a 8.76±0.85a 43.27±5.29a 26.27±3.52 HCMNCs 組HCMNCs group 6.32±0.67ab 7.32±0.74ab 58.94±6.18ab 34.51±4.16 F 34.768 32.804 50.393 43.855 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 心肌組織HE 染色Note. The arrow points to the infarct site.Figure 1 HE staining of myocardial tissue

圖2 CSFE 陽性細(xì)胞表達(dá)情況Note. The arrow points to CSFE positive cells.Figure 2 Expression of CSFE positive cells

圖3 BrdU 標(biāo)記細(xì)胞情況Note. The arrow points to BrdU positive cells.Figure 3 BrdU labeled cells

表2 心肌組織CD31 蛋白及MVD 水平(( ), n=10)Table 2 CD31 protein and MVD levels in myocardial tissue

表2 心肌組織CD31 蛋白及MVD 水平(( ), n=10)Table 2 CD31 protein and MVD levels in myocardial tissue

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與心梗組比較,bP＜0.05。Note. Compared with sham operation group, aP ＜0.05. Compared with myocardial infarction group, bP＜0.05.

組別Groups CD31 微血管密度(number/mm2)MVD假手術(shù)組Sham operation group 93.26±9.24 8.56±0.85心梗組Myocardial infarction group 43.35±7.28a 4.15±0.62a HCMNCs 組HCMNCs group 75.16±8.41ab 6.92±0.73ab F 91.593 90.897 P＜0.001 ＜0.001

圖4 心肌組織CD31 免疫組化結(jié)果Note. The black arrow points to the positive expression of CD31,the white arrow points to the capillaries.Figure 4 CD31 immunohistochemical results of myocardial tissue

圖5 心肌組織VEGF 免疫組化結(jié)果Note. The arrow points to the positive expression of VEGF.Figure 5 VEGF immunohistochemical results of myocardial tissue

表3 心肌組織CD31、VEGF 蛋白相對表達(dá)水平(( ), n=10)Table 3 Relative expression level of CD31 and VEGF protein in myocardium

表3 心肌組織CD31、VEGF 蛋白相對表達(dá)水平(( ), n=10)Table 3 Relative expression level of CD31 and VEGF protein in myocardium

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與心梗組比較,bP＜0.05。Note. Compared with sham operation group, aP ＜0.05. Compared with myocardial infarction group, bP＜0.05.

組別Groups CD31 血管內(nèi)皮生長因子VEGF假手術(shù)組Sham operation group 0.73±0.06 0.62±0.06心梗組Myocardial infarction group 0.21±0.04a 0.14±0.04a HCMNCs 組HCMNCs group 0.35±0.05ab 0.25±0.04ab F 91.593 90.897 P＜0.001 ＜0.001

圖6 心肌組織CD31、VEGF 蛋白表達(dá)Figure 6 Expression of CD31 and VEGF protein in myocardium

心肌發(fā)生梗死后,梗死區(qū)周圍微血管循環(huán)功能發(fā)生障礙,血管數(shù)量減少,進(jìn)而加重心功能衰退,通過血管新生,內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管,可促進(jìn)缺血心肌血氧灌注,減少心肌細(xì)胞死亡,改善心功能[16]。CD31 是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,其標(biāo)記的MVD 是反應(yīng)側(cè)支循環(huán)的最可靠指標(biāo),VEGF 是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,通過激活下游因子,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化和增殖,參與調(diào)節(jié)毛細(xì)血管循環(huán)和內(nèi)皮組織修復(fù)[17]。 研究顯示,采用 HCMNCs 移植治療視網(wǎng)膜病變小鼠,可促進(jìn)視網(wǎng)膜新血管形成;治療缺血性腦卒中大鼠,VEGF 水平明顯升高,表明HCMNCs 具有促進(jìn)血管新生的作用[18-19]。 本研究免疫組化顯示HCMNCs 組CD31 和VEGF 表達(dá)較心梗組明顯增加,且MVD 水平明顯升高,進(jìn)一步Western bolt 檢測,CD31 和VEGF 蛋白相對表達(dá)水平顯著升高,提示HCMNCs 可促進(jìn)心肌梗死區(qū)域側(cè)支循環(huán)的建立,誘導(dǎo)血管新生,改善心功能。

綜上所述,HCMNCs 能促進(jìn)AMI 大鼠側(cè)支循環(huán)建立,誘導(dǎo)血管新生,對缺血性心功能有明顯改善作用,對AMI 具有一定治療意義,為臨床治療急性心肌梗死提供理論依據(jù)。