秦艷萍,李曉龍,李慧茹,陸春果,楊 粵,張鈞雄

(廣西醫(yī)科大學(xué),南寧 530021)

免疫功能作為人體自身的防御機(jī)制,對維持免疫系統(tǒng)正常發(fā)揮保護(hù)作用具有重要意義,一旦某種原因使其不能正常工作,機(jī)體極易感染細(xì)菌、真菌、病毒等,最直接的表現(xiàn)就是容易生病。 因此,通過提高機(jī)體免疫功能進(jìn)而改善生命質(zhì)量,是一個值得探討研究的問題,尤其在疫情突發(fā)的非常時期,探索對抵御有害刺激具有較好預(yù)防作用,提高人體免疫功能的藥物更具意義。 目前已有的研究報道顯示,自然界豐富的天然藥物寶庫以及我國豐富的中藥寶典中,有不少的天然藥物,具有對人體適應(yīng)性及免疫雙向調(diào)節(jié)的功能,即通過服用此藥物使機(jī)體處于非特異性防御能力提高狀態(tài),促進(jìn)抗體形成,以提高解毒能力;同時誘生干擾素以對抗病毒;此外,對于亞健康人群,此類藥物在恢復(fù)健康方面亦有很好的調(diào)整作用[1]。 本文研究的是α- 倒捻子素(α-mangostin),一種氧雜蒽酮化合物,存在于藤黃科藤黃屬植物山竹(garcinia mangostanal)果殼中(約80%)[2-4]。 已有的研究表明,α-倒捻子素具有多種顯著的生物學(xué)效應(yīng)及藥理活性,如抗氧化、抗炎、抗過敏、抗菌及抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等,在一些東南亞地區(qū)被用作治療腹痛、腹瀉、痢疾等疾病的傳統(tǒng)藥物,但在我國這種 藥物的使用并不普及[5-7]。 此外,α-倒捻子素能夠通過影響細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用途徑,抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,對結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌等均表現(xiàn)出抗腫瘤活性[8-10]。 然而,基于目前研究發(fā)現(xiàn),有關(guān)α-倒捻子素對機(jī)體免疫功能的影響未見詳細(xì)報道,鑒于山竹果殼在其他方面具有多種藥用價值,但其對機(jī)體免疫功能是否具有影響尚未可知,因此值得探討研究。 本研究以免疫抑制小鼠為研究對象,旨在探討α-倒捻子素對免疫抑制小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用,為α-倒捻子素后續(xù)的研究及開發(fā)增強(qiáng)免疫功能新藥提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

50 只 6～8 周齡雌性 SPF 級 KM 小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(桂)2020-0003],體重(20±2)g。 飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(桂)2020-0004],經(jīng)由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會審批通過(201907018),實(shí)驗(yàn)研究過程中遵循3R 原則,置于清潔的動物房內(nèi)飼養(yǎng),給予充足的顆粒飼料和水,循環(huán)燈光(明/暗12 h)代替自然光照,室溫控制在22℃左右,濕度60%～80% 。 2 d 觀察適應(yīng)后進(jìn)行分組 。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞SK-HEP-1(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)。

1.2 主要試劑與儀器

α-倒捻子素(購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,Cas 號:6147-11-1);注射用環(huán)磷酰胺(CTX)(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,H32020857);補(bǔ)體(正常豚鼠血清) (上海源葉科技有限公司,S27068);含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液(上海善然生物科技有限公司,11011-8611);刀豆蛋白A(ConA)(北京索萊寶科技有限公司,C8110);MTT試劑(北京索萊寶科技有限公司,C8110);二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司,D8371)等。

電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司);超凈工作臺(上海博迅視野有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司);離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組和給藥方式

將全部小鼠隨機(jī)分為空白對照組、免疫抑制組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組10 只。 動物分組后,實(shí)驗(yàn)分2 步進(jìn)行:

實(shí)驗(yàn)總共21 d,每天定時對小鼠進(jìn)行灌胃,灌胃的劑量通過總結(jié)已有的研究,對不同劑量的效果進(jìn)行對比來設(shè)置。 前7 d,空白對照組小鼠每天灌胃0.3 mL 生理鹽水,其他四個組小鼠建模,每天均灌胃0.3 mL 環(huán)磷酰胺溶液(CTX)[劑量30 mg/(kg·d)]。 后14 d,空白對照組小鼠繼續(xù)灌胃同等劑量的生理鹽水,免疫抑制組小鼠灌胃0.3 mL/d 玉米油,低劑量組小鼠灌胃0.3 mL α-倒捻子素溶液[劑量10 mg/(kg·d)],中劑量組小鼠灌胃 0.3 mL α-倒捻子素溶液[劑量 30 mg/(kg·d)],高劑量組小鼠改灌胃0.3 mL α-倒捻子素溶液[劑量100 mg/(kg·d)]。 實(shí)驗(yàn)期間定期更換墊料,所有小鼠進(jìn)行自由采食和飲水,每天仔細(xì)檢查小鼠活動狀況,包括采食、飲水、反應(yīng)等),進(jìn)行體重稱量并記錄。 末次給藥24 h 后,分別進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)檢測:足趾增厚法,巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定:碳廓清實(shí)驗(yàn),免疫器官(脾、胸腺)指數(shù)測定,血清溶血素測定,自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)活性測定,外周血白細(xì)胞計數(shù)的測定和脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)檢測:足趾增厚法

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第17 天時,采用腹腔注射5%(v/v)雞血紅細(xì)胞(每個小鼠0.2 mL)進(jìn)行致敏。 4 d后,選取同一左后足趾部位,連續(xù)測量其厚度3 次,取平均值,作為攻擊前足趾厚度;第21 天時,在測量部位皮下注射20%(v/v)雞血紅細(xì)胞(每個小鼠20 μL),于注射后24 h 測量左后足趾部厚度3 次,取平均值,作為攻擊后足趾厚度。 DTH 程度用足趾腫脹程度即攻擊前后足趾厚度差值來表示。

1.3.3 巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定:碳廓清實(shí)驗(yàn)

小鼠置于固定器中,尾靜脈注射50%的印度墨汁(0.1 mL/10 g),注射后立即計時,并于第3 min(A3)、11 min(A11),分別用毛細(xì)玻璃管從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL,加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,混勻。 以0.1% Na2CO3溶液作為空白對照,3 復(fù)孔,每孔100 μL,運(yùn)用酶標(biāo)儀在600 nm 波長處測定A3和A11的密度值OD。 按下列公式計算碳廓清指數(shù)K 和吞噬指數(shù)a。

K=(logA3-logA11)/(t11-t3)

a=體重/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)×3K

1.3.4 免疫器官指數(shù)測定

采血完成后,處死小鼠,用無菌處理過的剪刀和鑷子取出肝、胸腺和脾,除去多余的結(jié)締組織和脂肪,稱重計算胸腺(A)指數(shù)和(B)指數(shù):

A=小鼠胸腺質(zhì)量/小鼠體重;B=小鼠脾質(zhì)量/小鼠體重

1.3.5 血清溶血素測定(HC50)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第17 天,連續(xù)5 d 采用腹腔注射法注射0.2 mL 的5%雞血紅細(xì)胞,進(jìn)行預(yù)免疫,末次給藥24 h 后取血,血液離心(3000 r/min,10 min),取上層血清,加入生理鹽水稀釋100 倍,取稀釋后的血清與5%雞血紅細(xì)胞懸液、10%的補(bǔ)體、生理鹽水各0.5 mL,混勻,放入37℃水浴鍋中靜置30 min后,立刻轉(zhuǎn)入冰水浴中終止反應(yīng),再次離心(2500 r/min,10 min)后取上清液,每孔100 μL,3 復(fù)孔,運(yùn)用酶標(biāo)儀于540 nm 波長處測定光密度值(A)。 用半數(shù)溶血值(HC50)來表示血清溶血素含量:

HC50=樣品光密度值A(chǔ)×稀釋倍數(shù)(100 倍)/雞血紅細(xì)胞半數(shù)溶血時的A 值

測定雞血紅細(xì)胞半數(shù)溶血時的A 值,取稀釋后的血清與10%補(bǔ)體各0.5 mL,再加入5%雞血紅細(xì)胞懸液0.25 mL 和生理鹽水0.75 mL。

1.3.6 外周血白細(xì)胞計數(shù)的測定

小鼠眼球取血后,取 20 μL 全血,加入 380 μL 2%的乙酸,混勻,取12 μL 混合液用細(xì)胞計數(shù)板測定外周血白細(xì)胞。

1.3.7 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):MTT 法

無菌條件下取脾,剪碎研磨,過200 目細(xì)胞篩,用無菌PBS 洗滌細(xì)胞,放入離心機(jī)(1500 r/min,5 min)離心,細(xì)胞沉淀加入2 mL 滅菌雙蒸水,吹打混勻,立即加入等體積1.8%的無菌鹽水充分混勻,再用無菌的PBS 洗滌細(xì)胞,最后用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞個數(shù)為5×105/mL,加入96 孔板中,設(shè)空白對照組(只加細(xì)胞懸液)和 ConA 組(加終質(zhì)量濃度為5μg/mL ConA和細(xì)胞懸液),每組設(shè)3 個復(fù)孔,每孔80 μL,置5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后加入5 mg/mL MTT 15 μL,再培養(yǎng)4 h 后,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL,混勻,待結(jié)晶完全溶解后于570 nm波長處測定OD 值。 細(xì)胞增殖率=(OD 實(shí)驗(yàn)組-OD對照組)/OD 實(shí)驗(yàn)組×100%。

1.3.8 自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)活性測定:MTT 法

將靶細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞SK-HEP-1)稀釋至2×105/mL,制備好的脾細(xì)胞懸液和靶細(xì)胞懸液按50 ∶1的比例加入 96 孔板,3 復(fù)孔,每孔 100 μL。 設(shè)不加靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞對照孔和靶細(xì)胞對照孔,各孔用RMPI1640 培養(yǎng)液調(diào)零,置于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h,每孔加入5 mg/mL MTT 15 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL,混勻,待結(jié)晶完全溶解后于570 nm 波長處測定OD值。 NK 細(xì)胞的殺傷活性=[1-(OD 效靶細(xì)胞-OD效應(yīng)細(xì)胞)/OD 靶細(xì)胞]×100%。

表1 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響(,n=10)Table 1 Effect of α-mangostin in the delayed allergic reaction of immunosuppressed mice

表1 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響(,n=10)Table 1 Effect of α-mangostin in the delayed allergic reaction of immunosuppressed mice

注:與空白對照組比較,*P ＜0.05,**P ≤0.01;與免疫抑制組比較,△P＜0.05,△△P≤0.01。 下同。Note. Compared with normal control group,* P ＜ 0.05, **P ≤ 0.01.Compared with immunosuppression,△P＜0.05, △△P≤0.01. The same below.

ps α-倒捻子素劑量(mg/(kg·d))Dose of α-mangostin足趾腫脹度DTH(mm)Paw thickness index照組trol group 0 0.39±0.16制組ssion group 0 0.35±0.09組Low dose group 10 0.45±0.11中劑量組Middle dose group 30 0.40±0.10高劑量組High dose group 100 0.50±0.07*△

圖1 攻擊前、后足趾厚度(mm)Figure 1 The paw thickness index before and after the attack

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析處理,數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,P＜0.05 為差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

測定結(jié)果顯示(表1、圖1),免疫抑制組小鼠足趾腫脹度平均數(shù)在數(shù)值上低于空白對照組,但差異不顯著(P＞0.05)。 實(shí)驗(yàn)組中的低劑量組、中劑量組與空白對照組及免疫抑制組比較均無顯著差異(P＞0.05)。 高劑量組小鼠足趾腫脹度平均數(shù),其數(shù)值顯著高于空白對照和免疫抑制組,與空白對照組及免疫抑制組比較,差異顯著(P＜0.05)。

2.2 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

根據(jù)測定結(jié)果顯示(表2),各劑量組的碳廓清指數(shù)K 及吞噬指數(shù)a 與空白對照組及免疫抑制組比較均無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響

測定結(jié)果顯示(表3),免疫抑制組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)在數(shù)值上均顯著低于空白對照組,且具有顯著差異(P＜0.05)。 可見環(huán)磷酰胺對小鼠脾、胸腺的生長發(fā)育產(chǎn)生了明顯抑制作用,免疫抑制模型制備成功。 如圖2、圖3 所示,免疫抑制組的胸腺與脾均發(fā)生了萎縮,體積減小,而高劑量組與中劑量組的體積均比免疫抑制組的體積大。 與空白對照組比較,α-倒捻子素低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)數(shù)值上均有所減小,并且減小程度各異。 其中胸腺指數(shù)中,中劑量組、高劑量組與空白對照組的差異顯著(P＜0.05),低劑量組無顯著差異(P＞0.05)。脾指數(shù)中,各劑量組均與空白對照組有顯著差異(P＜0.05)。 與免疫抑制組比較,三個劑量組小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)在數(shù)值上均有所增大,且增大程度各異。 與免疫抑制組比較,高劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)平均數(shù)增大程度最顯著,分別達(dá)到(3.38±0.94)和(4.46±0.39)mg/g,α-倒捻子素可顯著提高高劑量組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù),差異顯著(P＜0.05);同時,α-倒捻子素還可顯著提高中劑量組的胸腺指數(shù)(P＜0.05),但脾指數(shù)則無顯著差異(P＞0.05);此外,α-倒捻子素對低劑量的脾指數(shù)無顯著的提高作用,無顯著差異(P＞0.05),但對低劑量組的胸腺指數(shù)可顯著提高,具有極顯著的差異(P≤0.01)。

2.4 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響

測定結(jié)果顯示(表4),免疫抑制組小鼠半數(shù)溶血值HC50低于空白對照組,具有顯著差異(P＜O.05),可見免疫抑制模型制備成功。 各劑量組其數(shù)值均高于空白對照組和免疫抑制組且高劑量組的數(shù)值最高。 與空白對照組比較,α-倒捻子素中劑量組具有顯著差異(P＜0.05),低劑量組和高劑量組具有極顯著的差異(P＜0.01)。 與免疫抑制組比較,中劑量組無顯著差異(P＞0.05),低劑量組具有顯著差異(P＜0.05),而高劑量組具有極顯著的差異(P＜0.01)。

2.5 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)

測定結(jié)果顯示(表5),高劑量組的數(shù)值最高。與空白對照組比較,除高劑量具有極顯著差異外(P＜0.01),其他組均無顯著差異(P＞0.05)。 與免疫抑制組比較,各劑量組除高劑量具有極顯著差異外(P＜0.01),低劑量組及中劑量組均無顯著差異(P＞0.05)。

圖2 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠胸腺生長情況的影響Note. Normal control group, Saline. Immunosuppression group,0.3 mL/d of corn oil. Middle dose group,30 mg/(kg·d) of αmangostin. High dose group, 100 mg/(kg·d)of α-mangostin.The same as below.Figure 2 Effect of α-mangostin on the thymus index of immunosuppressed mice

圖3 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠脾生長情況的影響Figure 3 Effect of α-mangostin on the spleen index of immunosuppressed mice

表2 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(, n=10)Table 2 Effect of α-mangostin on the activity of natural killer cells of immunosuppressed mice

表2 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(, n=10)Table 2 Effect of α-mangostin on the activity of natural killer cells of immunosuppressed mice

組別G空白Normal c免疫Immunosup低roups α-倒捻子素劑量(mg/(kg·d))Dose of α-mangostin碳廓清指數(shù)K/10-3 The K value for clearance of carbon particles吞噬指數(shù)a The phagocytic index對照組ontrol group 0 3.20±2.06 3.91±1.50抑制組pression group 0 1.77±1.46 2.68±0.95劑量組Low dose group 10 2.47±1.29 3.77±3.04中劑量組Middle dose group 30 3.31±1.28 4.20±1.99高劑量組High dose group 100 2.29±1.97 2.72±0.69

表3 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠胸腺及脾指數(shù)的影響(, n=10)Table 3 Effect of α-mangostin on the thymus and spleen index of immunosuppressed mice

表3 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠胸腺及脾指數(shù)的影響(, n=10)Table 3 Effect of α-mangostin on the thymus and spleen index of immunosuppressed mice

組別Groups α-倒捻子素劑量(mg/(kg·d))Dose of α-mangostin胸腺指數(shù)(mg/g)Thymus index脾指數(shù)(mg/g)Spleen index空白對照組Normal control group 0 4.42±0.69 4.61±0.59免疫抑制組Immunosuppression group 0 2.15±0.42* 2.73±1.09*低劑量組Low dose group 10 4.23±0.46△△ 2.45±0.73*中劑量組Middle dose group 30 2.90±0.80*△ 3.17±0.77*高劑量組High dose group 100 3.38±0.94*△ 4.46±0.39*△

2.6 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

測定結(jié)果顯示(表5),與空白對照組比較,免疫抑制組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率顯著低于空白對照組,但無顯著差異(P＞0.05)。 各劑量組對應(yīng)的脾淋巴細(xì)胞增殖率數(shù)值上均高于空白對照組和免疫抑制組,高劑量組的數(shù)值最高。 與空白對照組比較,低劑量組和中劑量組差異顯著(P＜0.05),而高劑量組的差異極顯著(P≤0.01)。 與免疫抑制組比較,中劑量組可提高脾淋巴細(xì)胞增殖率(P＜0.05)而低劑量組和高劑量組更明顯,差異極顯著(P≤0.01)。

2.7 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)活性的影響

測定結(jié)果顯示(表5),與空白對照組比較,免疫抑制組小鼠NK 細(xì)胞活性低于空白對照組,無顯著差異(P＞0.05)。 各劑量組相對應(yīng)的NK 細(xì)胞活性數(shù)值均高于空白對照組和免疫抑制組。 與空白對照組比較,各劑量組均有顯著差異(P＜0.05)。 與免疫抑制組比較,α-倒捻子素三個劑量組都能提高NK細(xì)胞活性(P＜0.05),而高劑量組可明顯提高NK 細(xì)胞活性,差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

動物機(jī)體的免疫功能主要是由細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫組成,免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定是保證內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵,同時免疫功能的正常水平與各器官功能正常發(fā)揮具有密切聯(lián)系[11-12]。 在已有的研究中,不少學(xué)者是通過免疫器官指數(shù)測定、血清溶血素的測定以及碳廓清實(shí)驗(yàn)等來分別檢測機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)、體液免疫狀態(tài)及非特異性免疫狀態(tài)[13]。 免疫抑制是機(jī)體非特異性免疫功能異常的一種現(xiàn)象,是指免疫應(yīng)答的抑制作用,表現(xiàn)為機(jī)體免疫系統(tǒng)對抗原信息的刺激應(yīng)答反應(yīng)遲緩、滯后,甚至不產(chǎn)生應(yīng)答,從免疫器官的發(fā)育到體內(nèi)各種免疫功能的指標(biāo)均大大低于正常動物[14]。 研究發(fā)現(xiàn),目前建立免疫抑制模型比較常用藥物有環(huán)磷酰胺、氫化可的松和地塞米松等[15]。 本實(shí)驗(yàn)采用灌胃免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(CTX)來制備小鼠免疫抑制模型,通過免疫抑制組與空白對照組比較,證明了小鼠免疫器官的發(fā)育受阻以及免疫功能降低,免疫抑制模型制備成功。 在機(jī)體的免疫功能下降時,胸腺、脾會相應(yīng)發(fā)生萎縮和體積減小,很多研究通過測定胸腺指數(shù)和脾指數(shù)來間接反映機(jī)體的免疫水平[16-18]。 本研究通過對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺、脾指數(shù)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)三種劑量的α-倒捻子素對小鼠的胸腺指數(shù)具有不同程度的提高作用(P＜0.05),但并不隨著劑量的增加而進(jìn)一步升高,同時與免疫抑制組比較,只有高劑量組的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均具有顯著差異(P＜0.05),表明α-倒捻子素對免疫抑制小鼠的免疫功能具有改善作用且存在其最適宜劑量。

表4 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響(, n=10)Table 4 Effect of α-mangostin on the hemolysin in serum(HC50) of immunosuppressed mice

表4 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響(, n=10)Table 4 Effect of α-mangostin on the hemolysin in serum(HC50) of immunosuppressed mice

組別Groups α-倒捻子素劑量(mg/(kg·d))Dose of α-mangostin半數(shù)溶血值HC50 The HC50 of serum空白對照組Normal control group 0 113.10±5.60免疫抑制組Immunosuppression group 0 112.52±8.78*低劑量組Low dose group 10 113.69±8.23**△中劑量組Middle dose group 30 123.63±12.76*高劑量組High dose group 100 135.03±6.43**△△

表5 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)(, n=10)Table 5 Effect of α-mangostin on the peripheral blood leukocyte count, splenocytes proliferation and the activity of natural killer cells (NK cells) of immunosuppressed mice

表5 α-倒捻子素對免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)(, n=10)Table 5 Effect of α-mangostin on the peripheral blood leukocyte count, splenocytes proliferation and the activity of natural killer cells (NK cells) of immunosuppressed mice

組別Groups α-倒捻子素劑量(mg/(kg·d))Dose of α-mangostin白細(xì)胞計數(shù)(109)Leukocyte count脾淋巴細(xì)胞增殖率(100%)Proliferation rate of spleen lymphocytes NK 細(xì)胞活性The activity of NK cells空白對照組 Normal control group 0 2.62± 0.53 19.16±7.79 0.49±0.09免疫抑制組 lmmunosuppression group 0 2.70± 0.53 18.25±5.28 0.47±0.11低劑量組 Low dose group 10 2.68± 0.54 29.51±8.23*△△ 0.59±0.03*△中劑量組 Middle dose group 30 - 31.41±8.71*△ 0.62±0.12*△高劑量組 High dose group 100 5.04± 1.00**△△ 37.55±6.98**△△ 0.72±0.03*△△

已有研究表明脾臟和胸腺作為重要的免疫器官,具有豐富的淋巴細(xì)胞,而淋巴細(xì)胞是體內(nèi)免疫活性細(xì)胞,其增殖能力的強(qiáng)弱,一定程度上可以反映免疫功能的高低[19-21]。 機(jī)體發(fā)生炎癥時,白細(xì)胞數(shù)目將大量增加,從而達(dá)到刺激動物免疫功能增加的作用[22]。 溶血素作為體現(xiàn)體液免疫的一種途徑,通過改變血液的粘稠性,使其保持在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi),當(dāng)其生成增多時,紅細(xì)胞溶血會出現(xiàn)吸光度值提高的現(xiàn)象,表明機(jī)體的體液免疫有所增強(qiáng)[23-24]。巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,具有吞噬、殺傷及消化病原體的功能,并在特異性免疫應(yīng)答中參與抗原的加工與呈遞及免疫調(diào)節(jié),巨噬細(xì)胞的激活可使機(jī)體抗感染能力提高,從而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能[16,19]。 本研究結(jié)果顯示,與免疫抑制組比較,中劑量組可提高脾淋巴細(xì)胞增殖率(P＜0.05)而低劑量組和高劑量組更明顯,差異極顯著(P≤0.01),表明最適宜劑量存在一定范圍內(nèi)。 而在血清溶血素實(shí)驗(yàn)中,與免疫抑制組相比,中劑量組無顯著差異(P＞0.05),低劑量組可提高半數(shù)溶血值(P＜0.05),高劑量組可顯著提高半數(shù)溶血值(P＜0.01)。 NK細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞以及固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞,具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[25-26],研究結(jié)果顯示,α-倒捻子素三個劑量組也都能提高NK 細(xì)胞活性(P＜0.05),但只有高劑量組可明顯提高NK 細(xì)胞活性,差異極顯著(P＜0.01)。 與此同時,在外周血白細(xì)胞計數(shù)測定及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中,與免疫抑制組比較僅有高劑量組有顯著差異(P＜0.05)。 綜合上述分析,研究結(jié)果顯示高劑量組小鼠免疫功能的改善效果最為明顯,表明α-倒捻子素的最適劑量更偏向于高劑量,在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。 本研究中α-倒捻子素對小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫的提高作用由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可得,但在碳廓清實(shí)驗(yàn)中,本研究的各劑量組均無統(tǒng)計學(xué)意義,對比黃偉寬、劉哲慧等學(xué)者在此類研究中的所設(shè)計的實(shí)驗(yàn)方法與所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13-14,19],本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的個別實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常以及各實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異,可能是由藥品種類差異、劑量差異、實(shí)驗(yàn)方法不完善及實(shí)驗(yàn)的動物數(shù)量有限等原因造成,因此仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。 免疫功能是多方面免疫能力共同作用的結(jié)果,α-倒捻子素對小鼠不同方面免疫能力的影響存在差異,但在整體上未影響本研究對免疫力作用結(jié)果的判斷。

綜上所述,我們的研究表明α-倒捻子素通過改善和提高免疫抑制小鼠免疫器官的修復(fù)能力及免疫細(xì)胞的增殖能力,對其免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)和提高,α-倒捻子素對免疫抑制小鼠免疫功能改善的最適宜劑量更偏向于高劑量,在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。 而關(guān)于α-倒捻子素如何誘導(dǎo)免疫抑制小鼠免疫功能改善和提高的機(jī)制還需要深入研究,為α-倒捻子素的臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。