阮蕾穎,施梅言,古文鵬,邱丹丹,陸彩霞,罕園園,王文廣,代解杰,孫曉梅

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所, 昆明 650118)

維生素D(vitamin D, VD)是機體重要的信號分子,在骨骼發(fā)育、機體鈣和磷穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[1]。 維生素D 本身沒有活性,需要經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化,其代謝分為三個主要步驟:25-羥基化,1α-羥基化和24-羥基化,均由細胞色素P450 多功能氧化酶(CYPs)來完成[2]。 維生素D 代謝酶通過調(diào)節(jié)1,25(OH)2D 的細胞內(nèi)濃度從而激活維生素 D 受體(vitamin D receptor, VDR),引發(fā)機體對VD 的應答反應[3]。 因此,VD 的利用很大程度上依賴于維生素D 代謝酶和VDR 的表達[2,4-5]。

雄性生殖系統(tǒng)是維生素D 重要的靶標,隨著維生素D 代謝異常的不育男性增加,引發(fā)了人們對維生素D 代謝影響雄性生育的研究。 維生素D 代 謝 酶 CYP2R1 (cytochrome P450 family 2 subfamily R member 1, CYP2R1 )、 CYP27B1(cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1,CYP27B1),CYP24A1(cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1, CYP24A1)被發(fā)現(xiàn)廣泛分布于雄性生殖系統(tǒng)中。 VDR 和維生素 D 代謝酶主要在成年男性睪丸的生殖細胞中表達,表明維生素D 的局部代謝對精子的活性或功能十分重要[6],同時也在分泌性激素的睪丸間質(zhì)細胞中表達,證明VD 代謝與性激素有直接的聯(lián)系[7]。提示VD 在睪丸中的代謝可能獨立于全身VD 代謝,VD 可能通過自分泌和旁分泌來影響男性生育能力[8]。 值得關注的是CYP24A1 已經(jīng)被證實可以用來檢測男性精子質(zhì)量,可很好的區(qū)分不育和可育男性[7]。 臨床研究中,CYP24A1 的表達與精子的濃度、活力和形態(tài)呈正相關,且大于80%的CYP24A1 陽性精子在其頸部和頭部區(qū)域表達VDR,不育男性的精子VDR 和CYP24A1 的表達水平顯著低于可育男性[9]。 對大、小鼠的研究發(fā)現(xiàn)VDR 在睪丸組織中廣泛表達。 維生素D代謝酶在實驗動物中的研究較少。 Yao 等[10]通過對羊的生殖系統(tǒng)檢測,發(fā)現(xiàn)這些蛋白在羊生殖系統(tǒng)的不同發(fā)育階段和不同精子來源中表達各異。 在射精精子中檢測到了CYP24A1 和VDR,表明VD 的調(diào)節(jié)與精子成熟有關。 高活動性精子中VDR 和CYP24A1 的顯著高表達,這一結(jié)果與臨床研究結(jié)果相符合[8]。 雖然多項研究都證明了VD 代謝對雄性生殖系統(tǒng)有重要的影響,但是其確切機制尚待進一步闡明[9,11]。

樹鼩(Tree shrew,tupaia belangeri)作為一種實驗動物新資源,從野外引種、馴化到人工飼養(yǎng)過程中雖已攻克了一系列繁殖關鍵技術,但較常規(guī)實驗動物而言繁殖率還是有限,我們發(fā)現(xiàn)約有20%～30%的人工繁殖成年雄性樹鼩,雖然發(fā)生交配行為,但不能使正常雌性樹鼩成功受孕,對雄性種樹鼩的選育和繁殖種群造成極大影響。 實驗室曾開展過不育組和可育組血清VD 含量的檢測,但結(jié)果顯示無差異。 在排除飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)、疾病等影響因素外,基于前人的報道,我們假設樹鼩由于睪丸中VDR 或維生素D 代謝酶表達低或缺乏導致其低生育能力或不育。 因此本研究從VDR 與維生素D 代謝酶轉(zhuǎn)錄水平入手,重點評估CYP24A1 表達水平,與生育功能正常的樹鼩作比較,分析雄性樹鼩生育力低下的原因,為檢測雄性樹鼩生育能力、提高種群繁殖效率提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

人工飼養(yǎng)繁殖的普通級成年雄性樹鼩10 只,年齡2～3 歲,均具有清晰個體繁殖檔案。 將育齡期雄性樹鼩與正常分娩史的雌性按1 ∶1合籠飼養(yǎng)至少兩個月,并觀察。 對有交配行為的動物定期進行孕檢。 如該雄性樹鼩未能使與其交配的雌性樹鼩受孕,并在接下來以同樣方式更換交配伴侶4 次及以上,均未能使雌性受孕的雄性設為生殖障礙組。 能使雌性樹鼩受孕,并產(chǎn)下健康幼崽的雄性樹鼩設為正常組,每組各5 只。 動物由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供[SCXK(滇)K2018-0002],體重120 ～160 g,在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心飼養(yǎng)[SYXK(滇)K2018-0002]。 本研究中涉及動物的實驗操作已經(jīng)得到本所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)的批準(DWSP202008002),所有動物按照3R 原則予以關懷。

1.2 主要試劑與儀器

RNAzol、 one step QPCR 試 劑 盒 購 自 日 本TaKaRa 公司;蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所;Western blot 電泳凝膠試劑盒購自美國BIO-RAD 公司;CYP24A1 抗體為免疫熒光和Western blot 通用抗體,購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;DMEM/F12 培養(yǎng)基購自美國BI;免疫熒光二抗Donkey anti rabbit 購自Abcam 公司。

熒光定量 PCR 儀(美國 BIO-RAD,型號 CFx-96);超速離心機(德國Sartorius,型號L8-80 M);梯度PCR 儀(日本TaKaRa,型號TP600);倒置熒光顯微鏡(日本Nikon,型號尼康Ti;電泳儀和電泳槽(美國BIO-RED)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物采樣

腹腔注射0.3 mL 3%戊巴比妥鈉進行麻醉,手術取出一側(cè)睪丸,去除表面附著的膜及附睪,每份樣品分為3 份,其中2 份迅速置于冰上,用于核酸和蛋白提取;1 份甲醛固定進行病理切片。

1.3.2 睪丸組織病理觀察

取睪丸中間部分的組織塊放入多聚甲醛中固定。 將固定好的睪丸組織依次放入80%、90%、95%和100%濃度的乙醇中2 h,進行脫水。 將組織浸入石蠟中包埋。 用切片機對包埋好的組織切片,厚度控制在4～6 μm。 將切片放入60℃～65℃恒溫箱中15～30 min 脫蠟。 對樣品進行 HE 染色。

1.3.3 QPCR 檢測 VDR 及 VD 代謝酶 mRNA 表達水平

將準備好的睪丸組織剪碎,每份樣品加入1 mL RNAzol 快速研磨至勻漿狀態(tài),13000 r/min 離心5 min 取上清,后按照RNAzol 說明書指導提取組織RNA,用紫外分光光度計測定總RNA 濃度,A260/A280 ≥1.80 視為合格,-80℃ 保存樣品。 使用Takara one step QPCR 試劑盒進行 PCR 反應,反應條件為95℃ 30 s,退火58℃ 30 s, 延伸72℃ 30 s,40 個循環(huán)。 采用雙標準曲線法計算相對表達量。引物序列見表1。

1.3.4 蛋白印跡法檢測CYP24A1 蛋白表達水平

取各組睪丸樣本剪碎后置于冰上按照比例每10 mg 加入200 mL 裂解液,快速研磨至勻漿狀態(tài)。冰上裂解15～20 min,12000 r/min 離心10 min 取上清。 按照碧云天蛋白濃度測定試劑盒說明進行蛋白濃度測定。 使用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,使用封閉液搖床上封閉樣品1 h,TBST 洗滌,加一抗孵育過夜用TBST 洗滌,加二抗在搖床上孵育2 h, 洗滌后用化學發(fā)光法成像。

1.3.5 免疫熒光檢測精子CYP24A1 表達情況

在超凈臺上將睪丸剪成小塊,加入配制好的培養(yǎng)基中,放置細胞培養(yǎng)箱5%CO2,37℃孵育30 min,使精子爬出。 培養(yǎng)基配方:DMEM/F12、10%FBS、1%雙抗、1%L-谷氨酰胺、1%丙酮酸鈉、1 mmol/L 非必須氨基酸。

去除組織塊,取細胞懸液 2000 r/min 4℃離心5 min,棄上清,加入 2 mL 多聚甲醛室溫下固定10 min,2000 r/min 離心5 min,棄上清,根據(jù)底部沉淀量加入PBS 重懸。 用組化筆在載玻片上畫一個3 cm×2 cm 的橢圓,吸取一滴細胞懸液滴加在載玻片上,用接種環(huán)將液滴均勻涂滿圓圈,懸液勿接觸組化筆筆跡。 根據(jù)在光鏡下觀察細胞的密度,適當調(diào)節(jié)細胞懸液的濃度。 將制作好的樣品放置1 h 自然風干。

將樣品放置于濕盒中,滴加PBS 漂洗3 次,每次5 min。 滴加5%山羊血清封閉30 min,甩去多余的液體。 PBS 漂洗同上,滴加一抗,4℃過夜。 PBS漂洗滴加二抗,室溫孵育2 h, PBS 漂洗三次,滴加甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差()表示,采用兩獨立樣本的t檢驗進行分析,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 睪丸組織病理結(jié)果

對兩組樹鼩睪丸組織進行HE 染色,病理結(jié)果(圖1)所示,正常組曲細精管排列較緊密,管腔內(nèi)生精細胞較多(圖1A 和1B);生育障礙組曲細精管體積減小,排列疏松,形狀不規(guī)則,管腔內(nèi)生精細胞大量減少(黑色箭頭),少量管腔內(nèi)充滿嗜酸性組織液(紅色箭頭),(圖1C 和1D)。

2.2 睪丸VDR 和VD 代謝酶mRNA 表達情況及與生育情況的相關性分析

兩組樹鼩睪丸組織中 VDR 及 VD 代謝酶mRNA 表達情況如圖2 所示,生殖障礙組與正常組相比 VDR、CYP2R1、CYP27B1 的 mRNA 表達無明顯差異;CYP24A1 相比正常組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 睪丸CYP24A1 蛋白表達情況

根據(jù)mRNA 的結(jié)果,對表達差異顯著的基因CYP24A1 進行蛋白表達量的測定和比較分析。 如圖3 所示,正常組的CYP24A1 表達量明顯高于生殖障礙組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 精子涂片CYP24A1 免疫熒光檢測

正常組精子在頭部頸部和中段高表達CYP24A1(圖4A)。 生殖障礙組精子與生育組相比,生殖障礙組精子低表達或不表達CYP24A1(圖4B)。

3 討論

根據(jù)李濤等[12]的病理研究結(jié)果可知,與日本兔、大小鼠、比格犬等實驗動物相比,成年雄性樹鼩在生精管上皮細胞層數(shù)、精子數(shù)量都相對較少,曲細精管致密度相對較疏松,由此初步判斷樹鼩相對于其它實驗動物生育力較弱,樹鼩自身的這種生理特點使得其不能像常規(guī)實驗動物一樣高效率繁殖。本研究也顯示了相同的病理特征。 但由于本研究中使用的樹鼩為2 ～3 歲的動物,與李濤等[12]采集的1 歲以下樹鼩的睪丸結(jié)構(gòu)相比,顯得較為疏松,生精細胞較少,是由于年齡造成的。 從病理結(jié)果來看,生殖障礙組相對正常組曲細精管數(shù)量更加稀少,分布不均,生精細胞數(shù)目大量減少,這些差異可能是造成其生育力低下的原因之一。

圖1 樹鼩睪丸組織病理學觀察Note. A/B, Normal group. C/D, Reproductive disorders group.The black arrow points to the seminiferous tubules, and the red arrow points to the eosinophilic tissue fluid.Figure 1 Histopathological observation of testis of tree shrew

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequence list

本研究對生育正常和生殖障礙兩個組進行VDR 轉(zhuǎn)錄水平的檢測,比較后發(fā)現(xiàn)兩組間的VDR轉(zhuǎn)錄水平并沒有顯著差異,這與Yao 等[10]的實驗結(jié)果相似,他們發(fā)現(xiàn)在不同年齡段的羊的睪丸中VDR mRNA 表達水平差異不顯著,這可能是由于VDR 的轉(zhuǎn)錄水平在動物生長的早期階段就已經(jīng)趨于平穩(wěn)。另外,該結(jié)果與臨床研究發(fā)現(xiàn)不育男性精子VDR 表達水平明顯下降的結(jié)果不一致,這可能是由于物種和取材部位差異導致的。 研究顯示VDR 在生殖系統(tǒng)各組織中表達存在差異,可育男性主要在精子頭部細胞核表達[13];而大鼠僅在睪丸精原細胞、Sertoli細胞和精母細胞中有表達,精子中卻表達較弱[14]。小鼠中VDR 表達最強的是附睪頭部上皮細胞,在附睪尾部的精子中不表達[15]。 研究不同品系VDR 基因敲除小鼠對其生育力的影響,得到截然相反的結(jié)果,說明物種差異性較大[9,16]。 本研究僅對樹鼩睪丸組織的VDR 和維生素D 代謝酶開展了比較,導致了結(jié)果的局限性。 進一步開展VDR 在樹鼩生殖系統(tǒng)各組織結(jié)構(gòu)中的表達分布,將有助于對樹鼩生殖障礙原因的深入分析。 從本研究的數(shù)據(jù)來看VDR 的mRNA 在睪丸中的表達水平不能作為判斷雄性樹鼩生育力的有力指標。

CYP2R1 的作用是對維生素D3 進行25-羥基化,將其轉(zhuǎn)化成25-(OH)D 從而完成維生素D 向活性形式轉(zhuǎn)化的第一步[17]。 我們的實驗結(jié)果中兩組睪丸樣品CYP2R1 mRNA 表達量無統(tǒng)計學差異,且組內(nèi)個體間的表達量差異較大,因此我們假設CYP2R1 的表達受自身其它因素的影響較大。 25-(OH)D 還需要通過CYP27B1 進行進一步的羥基化,最終生成有活性的骨化三醇1,25-(OH)2D[17]。本實驗結(jié)果顯示,CYP27B1 mRNA 在兩組睪丸中的表達沒有統(tǒng)計學差異,這可能是由于CYP27B1 作為VD 的幾種激活酶之一參與維生素D 代謝,其表達量的變化并不會直接影響維生素D 利用轉(zhuǎn)化的效率,因此受到維生素D 濃度變化的影響較小。 另一方面CYP27B1 轉(zhuǎn)錄水平可能在動物成年后達到穩(wěn)態(tài),使CYP27B1 轉(zhuǎn)錄基本保持穩(wěn)態(tài)而不容易因機體反饋調(diào)節(jié)的作用產(chǎn)生大的變化。

圖2 樹鼩睪丸VD 代謝酶及VDR 基因的相對表達量Note. Comparison of relative gene expression between normal group and reproductive disorder group, *P＜0.05.Figure 2 Relative expression levels of VD metabolic enzymes and VDR in the testis of tree shrews

圖3 正常組和生殖障礙組CYP24A1 蛋白表達比較Note. A, Western blot test results. B, Comparison of relative protein expression between groups, *P＜0.05.Figure 3 Expression of CYP24A1 in control group and abnormal group

雖然以上幾種蛋白都被認為是與雄性生殖密切相關的,但是目前只有CYP24A1 被認為是判斷人類男性精子質(zhì)量的金標準。 CYP24A1 在人精子環(huán)上表達,且與精子運動能力、濃度、數(shù)量呈正相關,通過檢測CYP24A1 的陽性率和表達量可以很好的將健康和不育男性區(qū)分開[18];該結(jié)果在羊中也得到了驗證[10]。 因此研究雄性生育能力時CYP24A1 是值得重點觀察的指標。 從本實驗結(jié)果可以看出,CYP24A1 的mRNA 和蛋白表達量在正常與生殖障礙組之間差異顯著。 免疫熒光檢測可以直觀的看到正常組動物的精子在其頭部、頸部和中段的位置高表達CYP24A1,而生殖障礙組低表達或不表達CYP24A1。 生育力強的組別高表達CYP24A1 這一結(jié)果與其他報道相一致[10,19]。 而CYP24A1 表達的位置似乎存在物種間的差異,如Jensen 等[7]的實驗發(fā)現(xiàn)＞80%的CYP24A1 在人精子的頭部和頸部高表達,而在羊中發(fā)現(xiàn)CYP24A1 僅在精子的頸部和中段高表達[10,18],本研究結(jié)果與人精子的表達位置更接近。

Yao 等[10]的實驗中還發(fā)現(xiàn)CYP24A1 在運動能力強的精子中高表達,因此推測高表達CYP24A1 的正常組樹鼩產(chǎn)生的精子活力更強,大大增加了受孕的幾率。 而對于精子運動能力弱、CYP24A1 表達低而引起不育的樹鼩,單純通過補充VD 可能并不能使其情況好轉(zhuǎn),這也被其他物種所證實[20],這是因為CYP2R1、CYP27B1 和CYP24A1 在睪丸中的水平?jīng)Q定了循環(huán)的維生素D 代謝產(chǎn)物對生殖功能的效力。 用膽鈣化固醇或骨化三醇處理性腺,VD 的作用可能會因這些酶在性腺中的表達情況而異。 膽鈣化固醇可以被逐步激活并產(chǎn)生反應,而骨化三醇已經(jīng)處于有活性狀態(tài),會立即產(chǎn)生反應或被滅活[6]。

綜上,CYP24A1 在樹鼩睪丸中的表達高低與其生育力有直接聯(lián)系,可以將睪丸組織和精子中CYP24A1 的表達情況作為評估樹鼩生育力的指標?；谇捌谖覀儗山M樹鼩血清檢測,VD 含量無差異的信息提示,單純補充VD 不能使這類樹鼩恢復生育力,可能需要通過尋找調(diào)控維生素D 代謝酶的關鍵因子入手來解決。