邢春蕊,陳應(yīng)奇,孫 曌,劉英蓮

(1.?？谑腥嗣襻t(yī)院健康管理體檢科, ?？?570802; 2.海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院,?？?570802)

隨著社會(huì)快速發(fā)展,生活節(jié)奏不斷加快以及工作壓力的增加,現(xiàn)代人失眠發(fā)病率不斷上升。 失眠是一種睡眠障礙類疾病,表現(xiàn)為入睡困難、睡眠維持時(shí)間短、早醒等[1]。 長時(shí)間失眠可導(dǎo)致一系列健康和心理問題,可誘發(fā)心腦疾病、糖尿病等,并可伴發(fā)抑郁癥,嚴(yán)重影響患者身體健康和生活質(zhì)量[2-3]。目前臨床上治療失眠主要有藥物療法和非藥物療法,長期使用藥物治療,易產(chǎn)生耐藥性及藥物成癮性,存在較大隱患。 中醫(yī)認(rèn)為,睡眠是一個(gè)節(jié)律性生理過程,正常睡眠與人體陰陽及五臟氣血密切相關(guān),失眠主要由機(jī)體陰陽失衡、氣血不足、臟腑功能失調(diào)及痰淤阻滯所致[4]。 針灸可以調(diào)虛實(shí)、平陰陽、通經(jīng)脈,通過針刺特定穴位治療失眠,經(jīng)濟(jì)、安全,且無副作用,被患者廣泛接受[5]。 針刺治療失眠臨床療效顯著,但其具體作用機(jī)制報(bào)道較少,本研究采用針刺特定穴位,評價(jià)其對對失眠大鼠癥狀的改善及自發(fā)活動(dòng)的影響,并對其具體作用機(jī)制進(jìn)行探討,以期為臨床治療失眠提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45 只 SD 大鼠,雄性,SPF 級,7 周齡,體重(200±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006],飼養(yǎng)于海南斯達(dá)制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(瓊)2016-0006],保持環(huán)境溫度20℃～25℃,相對濕度45%～65%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。 本研究經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(201803060027),實(shí)驗(yàn)過程給予人道關(guān)懷,符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

地西泮片(批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H11020898,北京益民藥業(yè)有限公司,每片2.5 mg);對氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine, PCPA)、谷氨酸(glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma 公司);質(zhì)譜級甲醇(美國Fisher 公司); 兔抗大鼠谷氨酸脫羧酶( glutamate decarboxylase, GAD) 多 抗、 谷 氨 酰 胺 合 成 酶(glutamine synthetase, GS)多抗[英國艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司];HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術(shù)有限);Synapt G2 超高效液相色譜-四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Water 公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、Varioskan LUX 酶標(biāo)儀(美國 Thermo Fisher 公司);DYY-6C 電泳儀(美國Bio-RAD 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模及分組

取35 只大鼠,采用腹腔注射PCPA 法[6]建立失眠大鼠模型,按400 mg/kg 大鼠體重稱取PCPA,研磨成細(xì)粉,加入適量生理鹽水,待研磨成泡沫狀后,用生理鹽水配制成100 mg/mL 的混懸液備用,臨用前震蕩調(diào)勻。 造模開始后,于每日上午 8 ∶00～10 ∶00腹腔注射PCPA,每天1 次,連續(xù)2 d。 模型判定標(biāo)準(zhǔn)[7]:第一次注射PCPA 后28～30 h,大鼠出現(xiàn)性情煩躁、晝夜節(jié)律紊亂、興奮性和攻擊性增強(qiáng),大便灰白等表示造模成功。 造模成功大鼠30 只隨機(jī)分為失眠組、針刺組、西藥組,每組各10 只。 剩余10 只為對照組,腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 干預(yù)方法

造模成功后12 h 開始干預(yù)。 所有大鼠,每日上午8:00～10:00,進(jìn)行治療。

對照組和失眠組:僅抓取、固定,灌胃生理鹽水。

針刺組:抓取固定大鼠后,取穴位置參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8],將局部皮膚消毒,取針于雙側(cè)申脈、照海穴平刺,針有下沉感后捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉,先補(bǔ)照海,后瀉申脈,留針15 min。 灌胃生理鹽水。

西藥組:僅抓取、固定,根據(jù)人與大鼠體表面積計(jì)算給藥量,灌胃地西泮0.9 mg/kg。

各組大鼠均每日干預(yù)1 次,連續(xù)7 d。

1.3.3 曠場實(shí)驗(yàn)檢測大鼠自發(fā)活動(dòng)

末次干預(yù)后24 h,曠場實(shí)驗(yàn)檢測大鼠自發(fā)活動(dòng)。采用100 cm×100 cm×50 cm 曠箱,底面分成25 個(gè)邊長4 cm 的正方形,曠場上方放置攝像頭,將大鼠放在正中格,觀察大鼠5 min 水平活動(dòng)情況和垂直活動(dòng)情況,水平活動(dòng)得分以爬行總格數(shù)計(jì);垂直活動(dòng)得分以直立次數(shù)計(jì)。 每只大鼠測試前使用乙醇噴灑曠箱消除上只氣味。

1.3.4 戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定戊巴比妥鈉引起100%大鼠睡眠的閾上劑量為45 mg/kg,以翻正反射消失1 min為睡眠,30 s 內(nèi)翻轉(zhuǎn)3 次為睡眠結(jié)束,記錄大鼠睡眠潛伏期(從注射開始至大鼠入睡所需的時(shí)間)和睡眠持續(xù)時(shí)間。

1.3.5 RT-qPCR 法檢測視交叉上核生物鐘基因水平

末次干預(yù)12 h,麻醉大鼠,斷頭取腦,用生理鹽水沖洗干凈,分離下丘腦,取出視交叉上核,保存于液氮中。 取液氮中保存視交叉上核50 mg,冰上研磨,加入TRIzol 裂解液,裂解細(xì)胞,提取總RNA,檢測RNA 的濃度和純度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。 反應(yīng)體系:模板 cDNA 2 μL,2×qPCR Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,加雙蒸水至總體積 20 μL。 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,45 個(gè)循環(huán),以 β-actin 為內(nèi)參基因,采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)水平。 引物序列:clock上游序列:5′-CTGACTATGCTAGCTAGCTAG-3′;下游序列:5′-AGTAGCTAGCTGATCGTAGCT-3′。per2 上游序列:5′-CGTGATGCTGCTAGCTGAC-3′;下游序 列:5′-ACATGTCCTAAGCTCAGCC-3′。β-actin上游序列:5′-ATAGATAGTGCACTGTACA-3′;下游序列:5′-ACTAAGTGCATGCATGCAT-3′。

1.3.6 高效液相檢測下丘腦GABA、Glu 含量

處死大鼠后[9],分離下丘腦,用生理鹽水沖洗干凈,-80℃保存。 取0.1 g 下丘腦組織,加入甲醇進(jìn)行勻漿,加入10 μL 內(nèi)標(biāo)靜置30 min,去除蛋白。將組織勻漿2000 r/min 離心10 min,取上清,加入0.1 mL 甲醇,2000 r/min 離心 10 min,取上清。 采用高效液相色譜法檢測腦中GABA、Glu 含量。 色譜條件:色譜柱為Acquity UPLC HSS PFP 柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:含 0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇溶液;流速為0.4 mL/min;進(jìn)樣量 2 μL。 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,正離子模式,選擇離子掃描(m/z) 104.072(GABA),203.035(Glu),離子源溫度為120℃,脫溶劑溫度為500℃,脫溶劑氣體流速為800 mL/min。

1.3.7 Western blot 法檢測下丘腦GAD、GS 蛋白表達(dá)水平

一部分下丘腦保存于液氮中。 取液氮保存下丘腦50 mg,加入RIPA 裂解液,冰上裂解,離心后去上清,用BCA 法蛋白定量,100℃水浴10 min,蛋白變性,蛋白上樣,進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入 1 ∶2000 稀釋的 GAD、GS、β-actin 一抗,4℃孵育過夜,TBST 洗膜,加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶5000),室溫孵育2 h,TBST 洗膜,加入ECL 顯影、定影,采用Image 圖像軟件分析蛋白灰度值,結(jié)果以目的蛋白/β-actin 表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

對照組大鼠精神活潑,活動(dòng)規(guī)律;失眠組出現(xiàn)明顯失眠特征,表現(xiàn)為白天夜晚活動(dòng)頻繁、睡眠減少、精神疲憊,對外界聲光刺激異常敏感;針刺組和西藥組一般行為狀態(tài)較失眠組有所改善,精神較好、活動(dòng)較規(guī)律。

2.2 各組大鼠自發(fā)活動(dòng)比較

水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分降低(P＜0.001,P＜ 0.01,P＜ 0.01,P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜0.01);與模型組比較,針刺組和西藥組水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分升高(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001);針刺組和西藥組水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 1。

2.3 各組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間比較

各組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組大鼠睡眠潛伏期延長,睡眠時(shí)間縮短(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.05,P＜0.05);與失眠組比較,針刺組和西藥組大鼠睡眠潛伏期縮短,睡眠時(shí)間延長(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001);針刺組和西藥組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表2。

2.4 各組大鼠生物鐘基因mRNA 水平比較

視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達(dá)量降低(P＜ 0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05);與失眠組比較,針刺組和西藥組視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達(dá)量升高(P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜0.001,P＜0.001);針刺組和西藥組視交叉上核clock、per2 mRNA 相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 3。

2.5 各組大鼠下丘腦 Glu、GABA、Glu/GABA 水平比較

下丘腦Glu、GABA、Glu/GABA 水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001)。與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組下丘腦Glu水平升高,GABA 水平降低,Glu/GABA 升高(P＜0.001,P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜ 0.05,P＜0.05,P＜0.001,P＜0.05,P＜0.05);與失眠組比較,針刺組和西藥組下丘腦Glu 水平降低,GABA 水平升高,Glu/GABA 降低 (P＜ 0.001,P＜ 0.001,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01);針刺組與西藥組下丘腦 Glu、GABA、Glu/GABA 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 4,圖 1。

2.6 各組大鼠下丘腦GAD、GS 蛋白水平比較

下丘腦GAD、GS 蛋白相對表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001,P＜0.001)。 與對照組比較,失眠組、針刺組和西藥組下丘腦GAD 蛋白相對表達(dá)量降低,GS 蛋白相對表達(dá)量升高(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001);與失眠組比較,針刺組和西藥組下丘腦GAD 蛋白相對表達(dá)量升高、GS 蛋白相對表達(dá)量降低(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001);針刺組和西藥組下丘腦GAD、GS 蛋白相對表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,P＞0.05)。 見表 5,圖 2。

表1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較(ˉx±s, n=10, min)Table 1 Comparison of the horizontal and vertical movement scores of rats in each group

表2 各組大鼠睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間比較(ˉx±s, n=10, min)Table 2 Comparison of sleep latency and sleep time of rats in each group

表3 各組大鼠生物種基因mRNA 水平比較(ˉx±s, n=10)Table 3 Comparison of mRNA levels of biological species in each group of rats

3 討論

睡眠是人體正常生理過程重要組成部分,具有解除疲勞和恢復(fù)體力作用,是維持身體健康和鞏固記憶的重要環(huán)節(jié)。 中醫(yī)認(rèn)為,人體五臟陰平陽秘,氣機(jī)升降條達(dá),營衛(wèi)運(yùn)行通暢,方可心神得養(yǎng)、寐寤正常。 失眠發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,導(dǎo)致失眠的病因包括情志失調(diào)、勞倦、體虛等多種因素,但其基本病機(jī)與陰陽失衡及臟腑功能失調(diào)擾亂心神有關(guān),治療失眠當(dāng)補(bǔ)虛瀉實(shí),以平衡陰陽、調(diào)理氣血、清心安神為主要原則[10-11]。 中醫(yī)治療失眠主要有中藥方劑、針灸及推拿等方法,針灸療法具有諸多優(yōu)點(diǎn),已成為臨床治療失眠的主要手段之一。 目前認(rèn)為針刺具有特異性和非特異性生物學(xué)效應(yīng),而針刺的特異性生物學(xué)效應(yīng)尚不十分明確,安慰/假針刺作為針刺對照研究,須不具備針刺特異性療效,其合理性尚存在爭議,故本研究未設(shè)置安慰/假針刺組,而將未針刺的失眠大鼠作為針刺組的對照,通過比較針刺組與失眠組相關(guān)指標(biāo)變化,探討針刺對失眠大鼠的改善作用。

表4 各組大鼠下丘腦GABA、Glu、Glu/GABA水平比較(ˉx±s, n=10)Table 4 Comparison of GABA, Glu and Glu/GABA levels in hypothalamus of rats in various groups

圖1 下丘腦色譜圖Figure 1 Chromatogram of hypothalamus

圖2 下丘腦GAD、GS 蛋白表達(dá)Figure 2 GAD and GS protein expression levels in hypothalamus

睡眠-覺醒周期是人體最基本的生物節(jié)律,在一定年齡階段,人類睡眠-覺醒周期相對恒定,失眠患者由于存在睡眠障礙,睡眠相對不足且覺醒時(shí)間相對延長,導(dǎo)致睡眠-覺醒周期發(fā)生紊亂。clock基因是重要的生物鐘基因,發(fā)生突變可導(dǎo)致神經(jīng)高度興奮引起睡眠減少。per2 是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的節(jié)律因子,其表達(dá)與長周期有關(guān),該基因突變可引起睡眠時(shí)間減少,覺醒時(shí)間延長。 臨床研究顯示,針刺對機(jī)體晝夜節(jié)律具有一定調(diào)整作用,失眠患者通過針灸治療,睡眠時(shí)間相對延長[12]。 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)針灸可恢復(fù)倒相活動(dòng)大鼠的自發(fā)活動(dòng)節(jié)律,使其失眠癥狀得到一定程度恢復(fù)[13]。 中醫(yī)認(rèn)為,失眠與陰陽蹺脈失調(diào)、衛(wèi)氣運(yùn)行不暢有關(guān),“申脈”、“照?！本c蹺脈相交,申脈通陽蹺脈,照海通陰蹺脈,陰陽蹺脈分別于照海、申脈而出,終會(huì)于目,司目之開合。 針刺二穴,陰陽相應(yīng),蹺脈功能得以恢復(fù),從而調(diào)節(jié)失眠[14]。 本研究基于蹺脈理論,通過針刺申脈、照海二穴位,調(diào)和陰陽,促進(jìn)蹺脈功能恢復(fù),結(jié)果顯示針刺組較失眠組大鼠自發(fā)活動(dòng)改善明顯,戊巴比妥鈉協(xié)同鎮(zhèn)靜實(shí)驗(yàn)顯示針刺治療后睡眠潛伏期明顯縮短,睡眠時(shí)間明顯延長,同時(shí)生物鐘基因clock和per2 表達(dá)明顯升高,與西藥改善大鼠失眠效果相當(dāng),提示針刺對失眠大鼠具有一定改善作用,可調(diào)節(jié)其自發(fā)活動(dòng)節(jié)律,促使紊亂的睡覺-覺醒周期得以恢復(fù)。

Glu、GABA 分別是是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性/抑制性神經(jīng)遞質(zhì),其代謝主要通過Glu/GABA-谷氨酰胺(glutamine,Gln)代謝環(huán)路進(jìn)行循環(huán)[15]。 Glu 不能透過血腦屏障,通過三羧酸循環(huán)合成Gln,參與神經(jīng)調(diào)節(jié),Glu 可通過Glu-Gln 循環(huán)滅活,也可通過脫羧生成GABA,共同維持睡眠-覺醒周期。 GAD 是Glu/GABA-Gln 代謝環(huán)路中將Glu轉(zhuǎn)化為GABA 的主要代謝酶,GAD 表達(dá)降低,引起Glu 向GABA 轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙;GS 負(fù)責(zé)將Glu 轉(zhuǎn)化為Gln,維持不同神經(jīng)元之間Glu 的突觸傳遞。 Glu/GABA 代謝平衡是維持大腦正常生理活動(dòng)的基礎(chǔ),Glu 與GABA 神經(jīng)興奮/抑制功能失調(diào),Glu 過度積累易引起興奮性神經(jīng)毒性,與神經(jīng)疾病疾病密切相關(guān)[16]。 研究顯示,失眠患者體內(nèi) Glu/GABA 失衡,失眠動(dòng)物模型體內(nèi)Glu、GABA 含量較正常組明顯改變[17-18]。 本研究失眠組大鼠Glu 含量較正常組明顯升高,GABA 含量降低,Glu/GABA 升高,提示失眠大鼠體內(nèi)存在Glu/GABA 失衡現(xiàn)象;經(jīng)針刺治療后,Glu/GABA 有一定程度恢復(fù),且GAD 表達(dá)降低,GS 表達(dá)升高,提示針刺對失眠大鼠的改善作用可能是通過調(diào)節(jié)Glu/GABA-Gln 代謝環(huán)路中GAD 和GS蛋白表達(dá),從而恢復(fù)Glu/GABA-Gln 代謝平衡發(fā)揮作用。

綜上所述,針刺對失眠大鼠具有一定改善作用,其可能是通過調(diào)節(jié)GAD 和GS 蛋白表達(dá),恢復(fù)Glu/GABA-Gln 代謝平衡,從而改善睡眠狀態(tài),為臨床治療失眠提供一定理論基礎(chǔ)。