周麗麗,莫超然,劉心朗,孫毅紅,賈建新,楊占君

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014040)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常見的神經(jīng)退行性疾病之一,臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)異常[1],其主要病理學(xué)特征為黑質(zhì)致密部和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性丟失和路易小體的形成[2]。 目前,針對PD 患者的主要治療手段均可改善預(yù)后,但其確切地發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚[3-4]。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是PD 發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因素[5]。 在正常情況下,機(jī)體存在氧自由基清除系統(tǒng),腦組織內(nèi)主要有超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)等保護(hù)機(jī)體免遭氧自由基的損傷。 脂質(zhì)降解的毒性產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量能夠體現(xiàn)機(jī)體清除自由基的作用。 帕金森病患者多巴胺能神經(jīng)元變性的基本形式是細(xì)胞凋亡[6],許多基因及其產(chǎn)物可以參與多巴胺能神經(jīng)元變性的凋亡過程。

蒙藥香青蘭(Dracocephalum moldavica L.)是蒙古族習(xí)用數(shù)百年的天然藥材,香青蘭中的成分極其復(fù)雜,現(xiàn)已測得含有微量元素、揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸、多糖類、黃酮、甾體、萜類等[7]。 其中,黃酮類化合物含量豐富,且具有較強(qiáng)的抗氧化性[8]。 前期研究證明, 香青蘭總黃酮( total flavones of Dracocephalum moldavica L., TFDM)在腦缺血再灌注損傷中具有抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡的作用[9-10],但其是否與PD 發(fā)病相關(guān)仍未見明確報(bào)道。 因此,本實(shí)驗(yàn)研究TFDM 對PD 模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能、多巴胺能神經(jīng)元丟失與細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只 8 周齡 SPF 級(jí)雄性 C517BL/6J 小鼠(22±2)g,購自北京維通利華有限公司[SCXK(京)2019-0010]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物房中[SYXK(京)2017-0033],室溫(22 ± 1)℃,晝夜循環(huán) 12 h,小鼠可自由進(jìn)食、飲水。 動(dòng)物房所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循我國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》和“3R”原則執(zhí)行。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)通過(2016-033)。

1.2 主要試劑與儀器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)購自美國sigma 公司;香青蘭植物由內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院楊占君教授鑒定;TFDM 由包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院提供;SOD、MDA、GSH-Px 試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司;β-actin、Caspase-3、Bcl-2、Bax、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體購自Affinity Biosciences.;組織裂解液、蛋白酶抑制劑、IgG-HRP 抗體購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京中杉金橋科技有限公司;BCA 蛋白定量試劑盒購自Thermo;轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(型號(hào):XR1514-RZPM)購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TFDM 的提取和含量測定

采集香青蘭植物的地上部分研磨成粗粉,取300 g 植物粗粉放入三頸燒瓶,加入1500 mL 65%乙醇,浸泡過夜。 第2 天,將三頸燒瓶放入70℃水浴、當(dāng)燒瓶內(nèi)溫度達(dá)到60℃時(shí),連續(xù)攪拌2 h。 然后通過真空濃縮過濾得到香青蘭總黃酮醇溶液,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾蒸發(fā)掉乙醇溶液和水,最終得到香青蘭總黃酮,經(jīng)過紫外分光光度計(jì)測量總黃酮含量。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥

40 只小鼠隨機(jī)分為正常對照組(8 只)與模型組(32 只),模型組小鼠腹腔注射 30 mg/(kg·d)MPTP,正常對照組(normal control)注射等體積生理鹽水,連續(xù)7 d。 繼續(xù)飼養(yǎng),將模型組小鼠隨機(jī)分為模型組(model)、TFDM 低(TFDM-L,10 mg/kg)、中(TFDM-M,20 mg/kg)、高(TFDM-H,30 mg/kg)給藥治療組,每天每組小鼠給與相應(yīng)藥物灌胃處理;正常對照組和模型組均給與等體積生理鹽水灌胃處理,連續(xù)1 個(gè)月。

1.3.3 行為學(xué)評價(jià)實(shí)驗(yàn)

(1)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

將小鼠置于轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上,給予30 s 的適應(yīng)時(shí)間,然后啟動(dòng)轉(zhuǎn)棒式疲勞儀,使轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速在30 s內(nèi)達(dá)到26 r/min,記錄小鼠第一次從棒上跌落的時(shí)間(潛伏期)。 每只小鼠測3 次,每次間隔30 min,取平均值。

(2)爬桿實(shí)驗(yàn)

取50 cm 長,1 cm 粗鐵桿作為爬桿,爬桿上纏繞醫(yī)用膠布防止打滑,各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前1 周每天一次訓(xùn)練,于最后一次給藥治療結(jié)束進(jìn)行檢測。 檢測時(shí),將小鼠放置于爬桿上端,以小鼠雙前上肢接觸桿底平臺(tái)認(rèn)定為爬完全程,記錄爬完全長所需時(shí)間,每只爬桿3 次,取平均值。

1.3.4 組織取材

麻醉小鼠后,快速取出完整的腦組織,一部分在冰上取黑質(zhì)區(qū)域(結(jié)合小鼠腦組織圖譜,黑質(zhì)區(qū)位于前囟 2.46 ～4.04 mm,中線外 0.24 ～1.34 mm[11])于-80℃保存待用;一部分于4%多聚甲醛固定浸泡過夜。 采血針腹主動(dòng)脈取血,全血靜止30 min、4000 r/min,離心 15 min,取上清于-80℃保存待用。

1.3.5 ELISA 檢測

取出-80℃血清,分別按照SOD、MDA、GSH-Px試劑盒說明進(jìn)行操作,每組血清全部按照1:10 稀釋進(jìn)行檢測。

1.3.6 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

將固定好的腦組織進(jìn)行石蠟包埋切片,切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后、抗原修復(fù)10 min,內(nèi)源性過氧化物酶反應(yīng)15 min,PBS 洗3 次× 10 min,然后滴加一抗(TH 1 ∶1000,Caspase-3 1 ∶500,Bcl-2 1 ∶500, Bax 1 ∶500)4℃ 孵育過夜。 第二天,滴加二抗(IgG 1 ∶1000)室溫孵育 20 min,PBS 洗 3 次×10 min,DAB 顯色3 min,蘇木素復(fù)染30 s,乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片。 在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像,利用Image J 軟件分析統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.3.7 Western blot 檢測

取出 - 80℃腦組織加入組織裂解液研磨、超聲破碎,再加入蛋白酶抑制劑冰上反應(yīng)30 min,12000 r/min 4℃低溫離心15 min,取上清,BCA 法測定蛋白濃度。 電泳100 V 2.5 h,轉(zhuǎn)膜400 mA 2 h,5% 脫脂奶粉封閉 1.5 h,孵育一抗(β-actin 1 ∶1000、TH 1 ∶1000、Caspase-3 1 ∶1000、Bcl-2 1 ∶1000、Bax 1 ∶1000)4℃過夜。 第二天,TBST 洗滌 3 次×10 min,孵育二抗(IgG 1 ∶3000)2 h,TBST 洗滌 3 次×10 min,ECL 發(fā)光液顯影并采集蛋白條帶,通過 Image J 軟件處理分析統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 香青蘭總黃酮化合物的分離提取和含量測定

經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾得到粉末狀的香青蘭總黃酮化合物提取物,電子天平稱量為50.5 g;利用紫外分光光度計(jì)測量得到總黃酮含量為322.8 mg/g。

2.2 TFDM 對PD 模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響

在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中,與正常對照組相比,模型組小鼠下落潛伏期顯著降低(P＜0.01),與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組下落潛伏期顯著增高(P＜0.05),低劑量治療組沒有顯著變化(P＞0.05),見圖1a;在爬桿實(shí)驗(yàn)中,與正常對照組相比,模型組PD 小鼠的爬桿時(shí)間明顯增高(P＜0.05),與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組爬桿時(shí)間顯著降低(P＜0.05),低劑量治療組沒有顯著變化(P＞0.05),見圖1b。

2.3 TFDM 對PD 小鼠血清中氧化應(yīng)激因子的影響

ELISA 檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組血清中 MDA 的含量顯著升高(P＜0.01),同時(shí)GSH-Px、SOD 的表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,TFDM 各治療組MDA 的含量明顯降低(P＜0.05),GSH-Px 的表達(dá)明顯升高(P＜0.05),而中、高劑量治療組SOD 的表達(dá)明顯升高(P＜0.05),低劑量治療組SOD 的表達(dá)沒有明顯變化(P＞0.05),見表1。

圖1 TFDM 對帕金森模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能影響(n=8,ˉx ± s)Note. A, Normal control group. B, Model group. C, TFDM-L. D,TFDM-M. E, TFDM-H. a, Rota Rod test. b, Climbing Pole test.Compared with control group, *P＜0.05, **P ＜0.01. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 1 Effects of TFDM on motor function in Parkinson’s model mice in each group

表1 TFDM 對PD 小鼠血清中氧化應(yīng)激因子的影響( ,n=8)Table 1 Effects of TFDM on oxidative stress factors in serum of PD mice

表1 TFDM 對PD 小鼠血清中氧化應(yīng)激因子的影響( ,n=8)Table 1 Effects of TFDM on oxidative stress factors in serum of PD mice

注:A:正常對照組;B:模型組;C:低劑量組;D:中劑量組;E:高劑量組。 與對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05。Note. A,Normal control group. B,Model group. C,TFDM-L. D,TFDMM. E, TFDM-H. Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Compared with model group, #P＜0.05.

組別Groups SOD (U/mL) GSH-Px (mIU/mL) MDA (nmol/mL)A 85.03 ± 4.46 20.07 ± 0.62 1.14 ± 0.03 B 57.84 ± 3.59* 14.67 ± 0.49* 2.70 ± 0.33**C 62.72 ± 2.62 19.06 ± 0.62# 2.03 ± 0.16#D 66.89 ± 4.10# 18.38 ± 0.60# 1.67 ± 0.12#E 70.43 ± 3.66# 17.17 ± 0.58# 1.51 ± 0.11#

2.4 TFDM 對 TH 和凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3、Bcl-2、Bax 表達(dá)的影響

2.4.1 免疫組織化學(xué)

在細(xì)胞質(zhì)可見 TH、Caspase-3、Bcl-2 和 Bax 蛋白的陽性表達(dá),免疫組化圖像上細(xì)胞的胞核顯色為藍(lán)色,胞質(zhì)顯色為深棕黃色,確定為蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞。與正常對照組相比,模型組TH、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低,陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05),同時(shí)Caspase-3、Bax 表達(dá)水平顯著增加,陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P＜0.05);與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組TH、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),陽性細(xì)胞數(shù)目增加(P＜0.05),同時(shí) Caspase-3、Bax 表達(dá)水平明顯下降,陽性細(xì)胞數(shù)目減少(P＜0.05),低劑量治療組沒有明顯變化(P＞0.05),見圖 2a、2b、2c、2d。

圖 2 TFDM 對 TH、Caspase-3、Bcl-2 和 Bax陽性細(xì)胞表達(dá)的影響( ,n=4)Note. A, Normal control group. B, Model group. C, TFDM-L. D,TFDM-M. E, TFDM-H. a, b, c and d respectively represent the statistical results of TH, Caspase-3, Bcl-2, Bax immunohistochemical images and positive cells statistics The arrow positive cells that indicate protein expression. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 2 TFDM effects on TH, Caspase-3,Bcl-2 and Bax positive cells expression

2.4.2 Western bolt

與正常對照組相比,模型組TH、Bcl-2、Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),同時(shí)Caspase-3、Bax 表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05);與模型組相比,TFDM 中、高劑量治療組 TH、Bcl-2、Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05),同時(shí) Caspase-3、Bax 表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05),低劑量治療組沒有明顯變化(P＞0.05),見圖 3b、3c、3d、3e、3f。

3 討論

帕金森病已成為繼阿爾茲海默癥后第二常見的中老年神經(jīng)退行性疾病,而且發(fā)病率隨著年齡的增長而增加[12]。 目前,針對PD 患者的治療藥物主要分為消耗多巴胺或模擬多巴胺受體效應(yīng)的藥物[13],而這類藥物只能改善臨床運(yùn)動(dòng)癥狀,不能阻止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展,長期使用還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥。 因此,降低不良反應(yīng),尋找新的、行之有效的治療策略是目前研究的重點(diǎn)。

香青蘭,又名青蘭、摩眼子、枝子花等,屬唇形科青蘭屬植物,性味辛苦涼,具有清熱燥濕、涼肝止血的功效。 有研究顯示TFDM 具有較強(qiáng)的抗炎性、抗氧化作用,并對低氧環(huán)境所致的肺損傷具有保護(hù)作用[14-15]。 TFDM 可能通過抑制細(xì)胞的凋亡和自噬對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷有顯著保護(hù)作用[16-17]。TFDM 還具有減緩動(dòng)脈粥樣硬化的作用[18]。

MPTP 因其高度的脂溶性可進(jìn)入腦內(nèi)并在單胺氧化酶B 的作用下轉(zhuǎn)化為1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),低濃度可誘發(fā)腦黑質(zhì)細(xì)胞凋亡、多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性丟失,誘導(dǎo)動(dòng)物PD 的發(fā)生發(fā)展[19-20]。大量研究顯示,PD 模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能異常且多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少[21-22]。 爬桿實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)主要檢測PD 小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力[21]。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,MPTP 制備的PD 模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元減少,多巴胺分泌減少,導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿功能亢進(jìn),引起肌張力持續(xù)增高、運(yùn)動(dòng)遲緩,導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)功能發(fā)生障礙,證明PD 的模型建立成功。 經(jīng)過TFDM 治療小鼠的爬桿時(shí)間縮短、下落潛伏期增加,證明小鼠的運(yùn)動(dòng)速度增加,運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力提高,說明香青蘭總黃酮能夠改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。 免疫組化結(jié)果顯示TFDM 治療小鼠的多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)明顯增多,證明香青蘭總黃酮可以減緩多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性丟失,說明香青蘭總黃酮對PD 有神經(jīng)保護(hù)作用。

正常生理?xiàng)l件下,腦組織內(nèi)的活性氧(ROS)可被機(jī)體抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)清除。 當(dāng)PD 發(fā)生時(shí),隨抗氧化物質(zhì)含量下降,神經(jīng)元清除自由基能力降低,從而引起黑質(zhì)脂質(zhì)過氧化增強(qiáng),MDA 含量增加[23]。 也有學(xué)者證實(shí)帕金森病患者黑質(zhì)部GSH水平下降40%[24],SOD 活性也有所降低。 本研究結(jié)果顯示,TFDM 可以減輕氧化應(yīng)激的損傷,使MDA含量降低的同時(shí)提高SOD、GSH-Px 的活性。

凋亡是由多種分子調(diào)控的復(fù)雜過程,這些分子包括 Bax、Caspase-3,或者是 Bcl-2 和 Bcl-xl 等。Caspase 家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件,當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)激活Caspase-3,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,凋亡開始即呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。 Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)節(jié)因子之一[25]。 Bcl-2 可以抗細(xì)胞凋亡,Bax 可以促細(xì)胞凋亡[26],在調(diào)控條件下,Bcl-2 家族中抗凋亡和促凋亡蛋白的表達(dá)相對穩(wěn)定[27]。 兩蛋白間的比例決定是否發(fā)生細(xì)胞凋亡[28],當(dāng)Bcl-2/Bax 比值較低則細(xì)胞凋亡較重,反之則細(xì)胞凋亡較輕[29]。 本研究結(jié)果顯示,TFDM 可以通過降低Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平的同時(shí)增加Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平來抑制細(xì)胞凋亡對PD 小鼠的影響。 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程,TFDM具體通過哪個(gè)環(huán)節(jié)對PD 小鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用還不明確,還有待進(jìn)一步的研究。

圖 3 TFDM 對 TH、Caspase-3、Bcl-2、Bax 和 Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響( ,n=4)Note. A, Normal control group. B, Model group. C, TFDM-L. D,TFDM-M. E, TFDM-H. a, Group protein Western blot image bands. b, c, d, e, and f, The statistical results of TH, Caspase-3, Bcl-2, Bax and Bcl-2/Bax protein expression level. Compared with control group, *P ＜0.05. Compared with model group,#P＜0.05.Figure 3 TFDM effects on TH, Caspase-3, Bcl-2,Bax and Bcl-2/Bax protein expression

綜上所述,TFDM 對PD 模型小鼠具有改善運(yùn)動(dòng)功能障礙和減少多巴胺能神經(jīng)元丟失的作用,并可能通過抑制Caspase-3 蛋白活性、上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)在PD 模型小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。