蔡文臣,張詩匯,高一冰,牛婉麗,徐 洪,3,楊 方*

(1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河北唐山 063210; 2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河北唐山 063210;3.河北省器官纖維化重點實驗室,河北唐山 063210)

矽肺纖維化主要是由于長期吸入游離二氧化硅(SiO2)粉塵引起的,以矽結(jié)節(jié)形成和彌漫性肺間質(zhì)纖維化為主要病理變化的一種職業(yè)性肺病,發(fā)生機制尚未完全闡明[1]。 課題組前期通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),發(fā)現(xiàn)含 YEATS(Yaf9、ENL、AF9、SAS5、TAF14) 結(jié) 構(gòu) 域 蛋 白 4 ( YEATS domain containing protein 4, YEATS4)可能是實驗性矽肺模型進展的重要靶基因[2]。 YEATS4 是一種高度保守的,具有YEATS 家族結(jié)構(gòu)域的核蛋白[3]。 作為轉(zhuǎn)錄激活因子,YEATS4 參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。 課題組多年來對N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酰(N-acetyl-seranyl-aspartate-lysylproline, Ac-SDKP)的抗矽肺纖維化作用機制進行了系列研究[6-7]。 因此,本研究擬觀察Ac-SDKP 能否通過對YEATS4 的調(diào)節(jié),從而抑制巨噬細胞活化,發(fā)揮拮抗矽肺纖維化的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級 3 周齡 30 只雄性 Wistar 大鼠(180±10)g 購自北京維通利華動物技術(shù)有限公司[SCXY(京)2016-0008]。 于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心潔凈級動物房飼養(yǎng)[SYXK(冀)2020-0007], 室溫(22±2)℃,相對濕度40%～60%,自由飲水、進食,分籠喂養(yǎng)。 所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求(LX2019035),并按照實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實驗細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7(中國科學(xué)院上海細胞庫)。

1.2 主要試劑與儀器

動式染塵控制系統(tǒng)(天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司);兔抗I 型膠原(Collagen type I,COLI)(美國Abcom 公司);鼠抗YEATS4(美國Santa Cruz);鼠抗精氨酸酶-1(Arginase-1)(美國BD 公司);兔抗單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)(美國 Affinity 公司);α-微管蛋白(Tubulin alpha, Tublin α)(美國 Affinity 公司);二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)(美國 Sigma 公司);DMEM 培養(yǎng)基(以色列BI 公司);Ac-SDKP(瑞士Bachem AG公司);PV6000 通用型兩步法免疫組化試劑(北京中杉公司);二抗山羊抗兔,抗鼠IgG(美國KPL 公司);ECL 顯色試劑盒(美國GE 公司);蘇木精染色液(珠海貝索公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

采用HOPE-MED8050 動式染塵控制系統(tǒng)制備矽肺大鼠模型[2]。 實驗動物分組:①對照24 周組(Control 24 week, C24):吸入純凈氣至16 周后,腹腔埋入含有生理鹽水的微量緩釋膠囊;②矽肺24 周組(silicosis 24 week, S24):動式染塵以(50±10)μg/m3的濃度h/d,染塵至16 周后,腹腔內(nèi)埋入含有生理鹽水的微量緩釋膠囊;③Ac-SDKP 治療組(Ac-SDKP treatment 24 week, Ac24):動式染塵至16 周后,在大鼠腹腔內(nèi)埋入含有Ac-SDKP[800 μg/(kg·d)]的微量緩釋膠囊,均于24 周處理動物。 取右肺下葉組織置于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)石蠟

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差()表示。 采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析評估組間差異,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默 YEATS4 可抑制 SiO2 誘導(dǎo)的RAW264.7 活化

如圖1、表1 所示,Western blot 結(jié)果顯示,與siC組比較,siY-3 明顯減弱了 YEATS4 的表達(P＜0.05)。 如圖 2、表 2 所示,與 siC 組比較,沉默YEATS4 后,COL I、MCP-1、Arginase-1 表達明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 給予SiO2刺激 的 同 時 沉 默 YEATS4 后, COL I、 MCP-1、Arginase-1 表達也明顯降低(表3),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 Ac-SDKP 對 SiO2 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細胞中YEATS4 表達的調(diào)節(jié)作用

免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,與對照組比較,SiO2刺激組中 YEATS4 高表達;與 SiO2刺激組比較, Ac-SDKP 處理組中,YEATS4 陽性表達明顯降低(圖 3)。 如圖4、表 4 所示,與對照組比較,SiO2刺激組中 COL I、MCP-1、Arginase-1 和 YEATS4 蛋白表達均升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與SiO2刺激組比較, Ac-SDKP 處理組中,COL I、MCP-1、Arginase-1 和 YEATS4 蛋白表達均降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 YEATS4 沉默序列篩選Figure 1 YEATS4 silencing sequence screening

表1 YEATS4 沉默序列篩選Table 1 YEATS4 silencing sequence screening

圖 2 COL I、MCP-1、Arginase-1 蛋白在沉默YEATS4 的 RAW264.7 中的表達Figure 2 The levels of COL I, MCP-1 and Arginase-1 in RAW264.7 regulated by silencing YEATS4

表 2 COL I、MCP-1、Arginase-1 蛋白在沉默YEATS4 的 RAW264.7 中的表達Table 2 The levels of COL I, MCP-1 and Arginase-1 in RAW264.7 regulated by silencing YEATS4

表 3 COL I、MCP-1、Arginase-1 蛋白在 SiO2 誘導(dǎo)的沉默YEATS4 的 RAW264.7 中的表達Table 3 The levels of COL I, MCP-1 and Arginase-1 in silica-treated RAW264.7 regulated by siRNA-YEATS4

圖3 Ac-SDKP 對SiO2 誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞中YEATS4 表達的調(diào)節(jié)作用Figure 3 Ac-SDKP inhibits the high-expression of YEATS4 in RAW264.7 cells induced by silica

2.3 Ac-SDKP 對實驗性矽肺大鼠肺組織中YEATS4 的表達的調(diào)節(jié)作用

IHC 結(jié)果顯示,與 C24 周組比較,S24 周組中YEATS4 陽性表達主要定位于矽結(jié)節(jié)中的巨噬細胞;與S24 周組比較,Ac-SDKP 處理組中YEATS4 陽性表達細胞數(shù)量減少(圖5)。 如圖6、表5 所示,與C24 周組比較,S24 周組中 COL I、MCP-1、Arginase-1和YEATS4 表達均升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 與 S24 周組比較,Ac24 周組中,COL I、MCP-1、Arginase-1 和 YEATS4 蛋白表達明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 Ac-SDKP 對 SiO2 誘導(dǎo)的 RAW264.7細胞中YEATS4 表達的調(diào)節(jié)作用Figure 4 Ac-SDKP inhibits the high-expression of YEATS4 in RAW264.7 cells induced by silica

表4 Ac-SDKP 對 SiO2 誘導(dǎo)的 RAW264.7細胞中YEATS4 表達的調(diào)節(jié)作用Table 4 Ac-SDKP inhibits the high-expression of YEATS4 in RAW264.7 cells induced by silica

圖5 Ac-SDKP 抑制染塵大鼠肺組織中YEATS4 的高表達Figure 5 Ac-SDKP inhibits the increasing level of YEATS4 in rats exposed to silica

圖6 Ac-SDKP 抑制染塵大鼠肺組織中YEATS4 的高表達Figure 6 Ac-SDKP inhibits the increasing level of YEATS4 in rats exposed to silica

表5 Ac-SDKP 抑制染塵大鼠肺組織中YEATS4 的高表達Table 5 Ac-SDKP inhibits the increasing level of YEATS4 in rats exposed to silica

3 討論

課題組前期通過高通量測序技術(shù),在實驗性矽肺大鼠模型中篩選了與矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的長鏈非編碼RNA,而YEATS4 是其重要的靶基因之一[2]。 研究表明,YEATS 家族成員能夠選擇性識別組蛋白賴氨酸乙酰化位點,可促進賴氨酸巴豆?；?在轉(zhuǎn)錄后修飾方面起到了重要的調(diào)節(jié)作用,主要參與染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA 修復(fù)[9-13]。 在本研究中,以實驗性矽肺大鼠模型和體外SiO2誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞作為研究對象,發(fā)現(xiàn)了YEATS4主要定位于巨噬細胞,且其高表達伴隨著巨噬細胞活化指標Arginase-1、MCP-1 和纖維化指標COL I 表達的上調(diào),提示YEATS4 可能參與了實驗性矽肺進程,其主要作用可能與矽塵導(dǎo)致的巨噬細胞活化有關(guān)。

諸多研究顯示,YEATS4 作為一種致癌基因,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。 在非小細胞肺癌中,YEATS4 能夠激活P53 信號通路促進腫瘤細胞的增殖和遷移,采用基因沉默技術(shù)則能夠抑制該變化[14]。 其還可通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號促進胰腺癌和胃癌細胞遷移、增殖和侵襲[5,15]。另有研究顯示,YEATS4 在固有淋巴細胞及其祖細胞中高表達,并促進向輔助固有淋巴祖細胞分化,敲除YEATS4 小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞浸潤顯著減少[16]。 在本研究中,采用基因沉默技術(shù),下調(diào)YEATS4 后,在基礎(chǔ)水平和SiO2誘導(dǎo)水平均顯著下調(diào)了 Arginase-1、MCP-1 和 COL I 的表達水平,進一步提示沉默YEATS 能夠抑制巨噬細胞的活化。課題組前期研究表明,Ac-SDKP 可通過抑制巨噬細胞活化、肌成纖維細胞分化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程,從而發(fā)揮拮抗矽肺纖維化的作用[17-18]。 體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示,予以Ac-SDKP 能夠抑制矽肺大鼠和RAW264.7 細胞中 YEATS4 的表達, 同時下調(diào)Arginase-1、MCP-1 和 COL I 的表達水平,提示 Ac-SDKP 可能通過對YEATS4 的阻斷,從而發(fā)揮拮抗矽肺纖維化的作用。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)YEATS4 可在SiO2誘導(dǎo)的巨噬細胞活化中起到了重要調(diào)節(jié)作用,其可能是矽肺纖維化進展的重要環(huán)節(jié),采用基因沉默技術(shù)或給予Ac-SDKP,均能夠抑制YEATS4 表達的上調(diào),提示其可作為抗矽肺纖維化進展的一個有效靶點。 在今后的研究工作中,將深入研究矽肺纖維化進展中YEATS4 參與組蛋白乙?；?巴豆?；木唧w機制,為明確其功能提供進一步的理論和實驗依據(jù)。