王志國，饒艷偉

(1.赤峰市松山醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古 赤峰 024005；2.吉林省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長春 130021)

骨肉瘤是一種常見的骨癌，有很高的侵襲能力和強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，治療方法局限。手術(shù)治療是對(duì)骨肉瘤治療的主要方法，但還是很多轉(zhuǎn)移案例?；熓俏ㄒ挥行Э刂乒窍嚓P(guān)轉(zhuǎn)移的治療手段。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在多種癌癥的產(chǎn)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中扮演一個(gè)重要的角色，包括骨肉瘤。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的構(gòu)成蛋白被用來作為骨肉瘤診斷的分子生物學(xué)標(biāo)記。在很多研究中發(fā)現(xiàn)了抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以抑制骨肉瘤的分化、成瘤和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)異常的Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化也可以導(dǎo)致一些表觀遺傳學(xué)的改變[1]。齊墩果酸是一種天然的五環(huán)三萜類化合物，可以從120種藥草和蔬菜中提取出來。研究認(rèn)為齊墩果酸有很多種活性，主要為護(hù)肝作用，抗炎作用和抗腫瘤作用。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)齊墩果酸在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、骨肉瘤、肝癌和肺癌等腫瘤中有很好的抗癌作用[2-4]，其抗腫瘤活性的主要機(jī)制是細(xì)胞周期阻滯的誘導(dǎo)。但是齊墩果酸是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)骨肉瘤產(chǎn)生凋亡至今還沒有被闡述。

1 材料與方法

1.1藥品及主要試劑：齊墩果酸(美國 Sigma)，p-β-catenin蛋白抗體(美國 abcam)，Nuclear β-catenin蛋白抗體(美國 abcam)，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組：本次研究經(jīng)過赤峰市松山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。人骨肉瘤U2OS和KHOS細(xì)胞長春潤醫(yī)生物科技有限公司贈(zèng)予。U2OS和KHOS細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并保持一定的濕度。所有細(xì)胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，給予更換含不同濃度的齊墩果酸培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)分組：Con組：10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。OA組：40 μmol/ml的OA處理骨肉瘤細(xì)胞作用36 h。

1.2.2MTT檢測U2OS和KHOS細(xì)胞增殖率：按使用說明書用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法檢測細(xì)胞生存能力。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長570 nm)測定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測Sub-G0/G1值：骨肉瘤細(xì)胞在加入不同濃度的OA后，36 h收集細(xì)胞，加入70%的乙醇，通過碘化丙啶(PI，200 mg/ml)固定，之后通過Aria Ⅱ sorter流式細(xì)胞儀分析(BD Biosciences)，每組計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)出Sub-G0/G1值。

1.2.4Western Blot檢測U2OS和KHOS細(xì)胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表達(dá)：提取細(xì)胞總蛋白，Bio-Rad法測定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作，測定樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計(jì)算各條豆類灰度值，分析p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表達(dá)情況。目的蛋白與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的灰度值的比值進(jìn)行描述表達(dá)情況。

1.2.5TOPFlash Reporter分析：β-catenin入核之后才能觸發(fā)了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活化，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合后，形成復(fù)合物之后才能引導(dǎo)調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。因此，將數(shù)個(gè)拷貝的TCF/LEF的 DNA結(jié)合位點(diǎn)(AGATCAAAGGgggta，大寫堿基為DNA結(jié)合序列，小寫的堿基為間隔序列)克隆至含TA病毒最小啟動(dòng)子(Minimal TA viral promoter)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體中，構(gòu)建得到TOP-Flash質(zhì)粒(Millipore,MA)。本研究將TOP-Flash質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000(Invitrogen)混合后，TOP-Flash質(zhì)?？呻S著β-catenin的活性的改變，來影響了下游螢火蟲熒光素酶(pRL-TK)(40:1)(Promega,WI)的表達(dá)量。將上述混合物過夜，48 h候后，通過用細(xì)胞裂解液(Promega,WI)收集細(xì)胞，之后通過光度儀(Promega)測量熒光強(qiáng)度。取得通常以TOP/FOP的比值，即為Wnt信號(hào)通路活化的程度。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測骨肉瘤細(xì)胞增殖率：隨著OA濃度增加和作用時(shí)間延長，骨肉瘤細(xì)胞的增殖率呈濃度和時(shí)間依賴性。在40 μmol/ml作用36 h U2OS細(xì)胞增殖率為(51±3.6)%，KHOS細(xì)胞增殖率為(57.66±2.52)%。提示40 μmol/ml作用36 h骨肉瘤細(xì)胞有顯著毒性作用，見圖1。

圖1 MTT檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細(xì)胞增殖率

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細(xì)胞的Sub-G0/G1比值：與對(duì)照組相比，骨肉瘤U2OS和KHOSOA組的Sub-G0/G1比值水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細(xì)胞的Sub-G0/G1比值

2.3TOPFlash Reporter Assays檢測骨肉瘤細(xì)胞TCF/LEF的轉(zhuǎn)運(yùn)活性：對(duì)照組相比，OA組TCF/LEF比值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖3。

圖3 TOPFlash Reporter Assays檢測骨肉瘤細(xì)胞TCF/LEF的轉(zhuǎn)運(yùn)活性

2.4Western Blot檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細(xì)胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表達(dá)：與對(duì)照組相比，OA組p-β-catenin的表達(dá)水平增加(P<0.001)，而Nuclear β-catenin的表達(dá)水平降低(P<0.001)，見圖4。

圖4 Western Blot檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細(xì)胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表達(dá)

3 討論

Wnt/β-catenin通路主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的水平發(fā)揮作用，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin通過影響其末端的NH2降解結(jié)構(gòu)域被磷酸化，通過β-TRCP1或者β-TRCP1的復(fù)合被多聚泛素化，之后通過泛素蛋白酶體介導(dǎo)的降解系統(tǒng)降解[5-6]。當(dāng)Wnt受體出現(xiàn)時(shí)，與Wnt結(jié)合到受體復(fù)合物上，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白Dvl活化。活化Dvl引起GSK-3β被抑制，導(dǎo)致多蛋白復(fù)合物分解，β-catenin不能被泛素化降解，導(dǎo)致其發(fā)生堆積，之后被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF結(jié)合，進(jìn)而活化其下游的靶基因[7]。

本研究我們發(fā)現(xiàn)通過給予不同濃度的OA處理的骨肉瘤U2OS和KHOS細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率隨著濃度增加和時(shí)間的延長，增殖率逐漸降低，這說明OA可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖率，隨后流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)Sub-G0/G1比值水平也明顯增加，這說明了OA也能增加了U2OS和KHOS細(xì)胞的凋亡的發(fā)生。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，OA可以抑制膀胱癌、肝癌和乳腺癌等癌癥細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞凋亡[3,8-9]。為此研究進(jìn)一步探討OA是誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的，研究發(fā)現(xiàn)隨著OA濃度增加TCF/LEF的轉(zhuǎn)運(yùn)活性水平明顯降低，同時(shí)p-β-catenin的表達(dá)隨著OA的濃度增加而增高，Nuclear β-catenin的表達(dá)隨著OA的濃度增加而降低。這說明了OA影響著骨肉瘤細(xì)胞漿中的p-β-catenin水平，進(jìn)而降低細(xì)胞核中的β-catenin表達(dá)，引起下游基因TCF/LEF的轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低來影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。