王志國,饒艷偉
(1.赤峰市松山醫(yī)院骨科,內蒙古 赤峰 024005;2.吉林省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,吉林 長春 130021)
骨肉瘤是一種常見的骨癌,有很高的侵襲能力和強的轉移能力,治療方法局限。手術治療是對骨肉瘤治療的主要方法,但還是很多轉移案例。化療是唯一有效控制骨相關轉移的治療手段。Wnt/β-catenin信號通路在多種癌癥的產生、進展和轉移中扮演一個重要的角色,包括骨肉瘤。Wnt/β-catenin信號通路的構成蛋白被用來作為骨肉瘤診斷的分子生物學標記。在很多研究中發(fā)現(xiàn)了抑制了Wnt/β-catenin信號通路可以抑制骨肉瘤的分化、成瘤和轉移能力,同時也發(fā)現(xiàn)異常的Wnt/β-catenin信號通路活化也可以導致一些表觀遺傳學的改變[1]。齊墩果酸是一種天然的五環(huán)三萜類化合物,可以從120種藥草和蔬菜中提取出來。研究認為齊墩果酸有很多種活性,主要為護肝作用,抗炎作用和抗腫瘤作用。隨著現(xiàn)代醫(yī)學研究的進展,發(fā)現(xiàn)齊墩果酸在腦膠質瘤、乳腺癌、骨肉瘤、肝癌和肺癌等腫瘤中有很好的抗癌作用[2-4],其抗腫瘤活性的主要機制是細胞周期阻滯的誘導。但是齊墩果酸是否通過Wnt/β-catenin信號通路誘導骨肉瘤產生凋亡至今還沒有被闡述。
1.1藥品及主要試劑:齊墩果酸(美國 Sigma),p-β-catenin蛋白抗體(美國 abcam),Nuclear β-catenin蛋白抗體(美國 abcam),3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng)和實驗分組:本次研究經過赤峰市松山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意。人骨肉瘤U2OS和KHOS細胞長春潤醫(yī)生物科技有限公司贈予。U2OS和KHOS細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37℃,5% CO2的恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并保持一定的濕度。所有細胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養(yǎng)。當細胞培養(yǎng)24 h后,給予更換含不同濃度的齊墩果酸培養(yǎng)液;實驗分組:Con組:10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。OA組:40 μmol/ml的OA處理骨肉瘤細胞作用36 h。
1.2.2MTT檢測U2OS和KHOS細胞增殖率:按使用說明書用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]法檢測細胞生存能力。全自動酶標儀(波長570 nm)測定各孔OD值,計算細胞生存率。
1.2.3流式細胞術檢測Sub-G0/G1值:骨肉瘤細胞在加入不同濃度的OA后,36 h收集細胞,加入70%的乙醇,通過碘化丙啶(PI,200 mg/ml)固定,之后通過Aria Ⅱ sorter流式細胞儀分析(BD Biosciences),每組計數(shù)10 000個細胞,統(tǒng)計出Sub-G0/G1值。
1.2.4Western Blot檢測U2OS和KHOS細胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表達:提取細胞總蛋白,Bio-Rad法測定蛋白含量,然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作,測定樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計算各條豆類灰度值,分析p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表達情況。目的蛋白與內參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值的比值進行描述表達情況。
1.2.5TOPFlash Reporter分析:β-catenin入核之后才能觸發(fā)了經典Wnt信號通路活化,β-catenin與轉錄因子TCF/LEF結合后,形成復合物之后才能引導調控下游基因的轉錄。因此,將數(shù)個拷貝的TCF/LEF的 DNA結合位點(AGATCAAAGGgggta,大寫堿基為DNA結合序列,小寫的堿基為間隔序列)克隆至含TA病毒最小啟動子(Minimal TA viral promoter)的螢火蟲熒光素酶報告系統(tǒng)載體中,構建得到TOP-Flash質粒(Millipore,MA)。本研究將TOP-Flash質粒與脂質體2000(Invitrogen)混合后,TOP-Flash質粒可隨著β-catenin的活性的改變,來影響了下游螢火蟲熒光素酶(pRL-TK)(40:1)(Promega,WI)的表達量。將上述混合物過夜,48 h候后,通過用細胞裂解液(Promega,WI)收集細胞,之后通過光度儀(Promega)測量熒光強度。取得通常以TOP/FOP的比值,即為Wnt信號通路活化的程度。
2.1MTT檢測骨肉瘤細胞增殖率:隨著OA濃度增加和作用時間延長,骨肉瘤細胞的增殖率呈濃度和時間依賴性。在40 μmol/ml作用36 h U2OS細胞增殖率為(51±3.6)%,KHOS細胞增殖率為(57.66±2.52)%。提示40 μmol/ml作用36 h骨肉瘤細胞有顯著毒性作用,見圖1。
圖1 MTT檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞增殖率
2.2流式細胞術檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞的Sub-G0/G1比值:與對照組相比,骨肉瘤U2OS和KHOSOA組的Sub-G0/G1比值水平明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖2。
圖2 流式細胞術檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞的Sub-G0/G1比值
2.3TOPFlash Reporter Assays檢測骨肉瘤細胞TCF/LEF的轉運活性:對照組相比,OA組TCF/LEF比值明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖3。
圖3 TOPFlash Reporter Assays檢測骨肉瘤細胞TCF/LEF的轉運活性
2.4Western Blot檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表達:與對照組相比,OA組p-β-catenin的表達水平增加(P<0.001),而Nuclear β-catenin的表達水平降低(P<0.001),見圖4。
圖4 Western Blot檢測骨肉瘤U2OS和KHOS細胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表達
Wnt/β-catenin通路主要通過調節(jié)細胞質內的β-catenin蛋白進入細胞核內的水平發(fā)揮作用,細胞質內的β-catenin通過影響其末端的NH2降解結構域被磷酸化,通過β-TRCP1或者β-TRCP1的復合被多聚泛素化,之后通過泛素蛋白酶體介導的降解系統(tǒng)降解[5-6]。當Wnt受體出現(xiàn)時,與Wnt結合到受體復合物上,引起細胞內蛋白Dvl活化?;罨疍vl引起GSK-3β被抑制,導致多蛋白復合物分解,β-catenin不能被泛素化降解,導致其發(fā)生堆積,之后被轉運入細胞核,與TCF/LEF結合,進而活化其下游的靶基因[7]。
本研究我們發(fā)現(xiàn)通過給予不同濃度的OA處理的骨肉瘤U2OS和KHOS細胞后,細胞增殖率隨著濃度增加和時間的延長,增殖率逐漸降低,這說明OA可以抑制骨肉瘤細胞的增殖率,隨后流式細胞術發(fā)現(xiàn)Sub-G0/G1比值水平也明顯增加,這說明了OA也能增加了U2OS和KHOS細胞的凋亡的發(fā)生。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),OA可以抑制膀胱癌、肝癌和乳腺癌等癌癥細胞增殖和增加細胞凋亡[3,8-9]。為此研究進一步探討OA是誘導骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡的,研究發(fā)現(xiàn)隨著OA濃度增加TCF/LEF的轉運活性水平明顯降低,同時p-β-catenin的表達隨著OA的濃度增加而增高,Nuclear β-catenin的表達隨著OA的濃度增加而降低。這說明了OA影響著骨肉瘤細胞漿中的p-β-catenin水平,進而降低細胞核中的β-catenin表達,引起下游基因TCF/LEF的轉運活性降低來影響細胞凋亡的發(fā)生。