馬麗萍，劉小林

(連云港市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港 222023)

宮頸癌是我國目前發(fā)病率和致死率較高的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性群體的生命健康和生活質量[1]。近年來，隨著宮頸癌篩查技術的進步以及越來越多的抗癌藥物和靶向制劑出現(xiàn)，使得宮頸癌的治療取得了長足的進展；但是部分患者仍然存在較高的轉移或復發(fā)率，預后較差，因此尋找新的治療途徑一直是宮頸癌治療領域長期研究的重點[3]。腫瘤的發(fā)生涉及諸多因素參與，是一個極其復雜的病理過程[4]，所有的腫瘤都起源于組織干細胞或祖細胞，雖然干細胞在組織中所占的比例極少，但卻具有強大的致瘤性、轉移性、放化療抵抗性等惡性生物學特性[5]。由于目前尚缺乏確切的宮頸癌干細胞的具體形態(tài)或腫瘤細胞表面特異性標記物，從而限制了腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)在宮頸癌治療領域的進展，因此尋找特異性干細胞標志分子，有效地分離、純化干細胞，一直是腫瘤領域研究的熱點。目前研究較多的CSCs特異性表面標志物包括CD44、CD24、CD133等，但是尚未發(fā)現(xiàn)宮頸癌干細胞表面特異性標志分子。有研究顯示，細胞周期蛋白50A(cell division cycle 50A，CDC50A)在宮頸癌側群細胞(side population，SP)中可能呈高表達，基于此，本項研究主要探討CDC50A在原代宮頸癌細胞中的表達以及是否具備維持腫瘤干細胞特性的功能，旨在為臨床治療提供新的研究思路。現(xiàn)報告如下。

1 儀器與材料

1.1受試動物：Balb/c裸小鼠，8只，SPF級，雄性，4～6周齡，20～22 g，購自維通利華實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK(京)2007-0009。飼養(yǎng)在本實驗室SPF動物房內，自由飲水進食，本次研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2組織來源：本項研究選取2017年1月～2018年2月期間我院婦科進行宮頸手術的宮頸癌患者24例，所有患者具有完整的臨床資料。根據國際婦產科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology et and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2009臨床分期標準，其中Ⅰ期5例患者，Ⅱ期13例患者，Ⅲ～Ⅳ期7例患者。同時選擇同時期在我院行子宮全切除術的正常宮頸黏膜組織10例作為對照。

1.3主要試劑：DMEM/F12腫瘤干細胞培養(yǎng)基，美國GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA細胞消化液(0.25%)，北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；FBS胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗，美國ThermoFisher公司；Trizol，美國Invitrogen公司；二甲基亞砜，美國Sigma公司；CDC50A單克隆抗體、IgG-PE、IgG-FITC、CD31-PE、CD45-PE、CD140a-PE、CD235a-PE，美國BD Pharmagen公司；S-P免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯仿、異丙醇、無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水，安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司。

1.4主要儀器：HERcell1501型CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機以及各種型號的移液器，德國 Eppndorf公司；DI-CJ-2ND超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CX41倒置光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；電子分析天平，上海玉研科學儀器有限公司；恒溫水浴搖床，北京六一儀器廠；FACS Canto Ⅱ型流式細胞儀，美國BD公司。

1.5實驗方法

1.5.1宮頸癌原代細胞分離及培養(yǎng)：①取宮頸癌組織標本，置于無菌離心管中，加入DMEM培養(yǎng)液；②用無菌剪和無菌眼科鑷將組織剪成碎片；加入胰蛋白酶消化，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；③離心，棄上清；加入1 ml DMEM/F12培養(yǎng)基重懸；④經200 μm細胞篩過濾，離心，棄上清；加入1 ml DMEM/F12培養(yǎng)基重懸；獲得單細胞懸液；⑤調整細胞濃度至1×105個/ml，加入至細胞培養(yǎng)瓶中；⑥將獲得的原代細胞培養(yǎng)在含有10 ng/ml成纖維細胞生長因子和20 ng/ml上皮生長因子的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基中，將細胞置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代一次。

1.5.2流式細胞術分選：①取對數(shù)期生長的細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化2～3 min后，加入PBS吹打細胞數(shù)次，直至將細胞吹散，置入5 ml玻璃離心管中，100 rpm離心3 min，棄上清，加入PBS重懸，計數(shù)；②每組細胞分為五管，即空白對照管、同型對照管、PE補償管、FITC補償管、樣品管；③對照組不加抗體；④同型對照：取1×106個細胞加入2 μl IgG-FITC抗體，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑤PE補償管：取1×106個細胞加入CD31-PE、CD45-PE、CD140a-PE、CD235a-PE(Lin-PE)抗體各1 μl，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑥FITC補償管：取1×106個細胞加入CDC50A-FITC抗體1 μl，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；然后加入二抗，孵育10 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑦樣品管：取1×106個細胞加入CDC50A-FITC抗體、Lin-PE抗體各1 μl，40℃孵育30 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；然后加入二抗孵育10 min，離心3 min，棄上清，加入PBS重懸；⑧流式細胞儀進行流式檢測及分選，每組細胞設置10個平行對照，每個樣品重復檢測三次，取平均值。

1.5.3免疫組織化學染色法：按照檢測試劑盒說明書進行檢測。①取宮頸癌患者腫瘤組織或正常宮頸黏膜組織病理切片進行組織脫蠟；②抗原熱修復；③滅活內源性過氧化物酶；④封閉；⑤加入CDC50A一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦滴加DAB試劑顯色；⑦蘇木精復染；⑧顯微鏡下觀察。采用美國universal imaging porporation圖像分析儀統(tǒng)計灰度值。

1.5.4細胞分組：將細胞分為空白對照組(未分選細胞)，CDC50A+Lin-組，CDC50A-Lin-組。

1.5.5MTT法檢測細胞增殖：將分選后的細胞(1×103個/孔)單層接種至96孔板中，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組設置8個平行孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，每次取8個對照孔，每孔加入20 μl MTT，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl DMSO，置于振動器上震動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結晶物。將96孔板放置于450酶標儀上，檢測波長為570 nm，參比波長為450 nm處的吸光光度值(OD值)，計算平均值。

1.5.6裸鼠異種移植瘤模型試驗：無菌條件下，取對數(shù)期生長的CDC50A+Lin-細胞、CDC50A-Lin-細胞和未分選的細胞，調整細胞濃度(1×104-1×107個/ml)，各取0.2 ml接種于裸鼠腋下皮下，同時設未接種對照組。每周觀察1次，共觀察12周。

1.5.7細胞集落形成實驗：將 CDC50A+Lin-細胞、CDC50A-Lin-細胞和未分選的細胞分別置于6孔板中，250個細胞/孔，加入完全培養(yǎng)液，放入5%CO2、飽和濕度，恒溫37℃細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。14 d后，顯微鏡下觀察細胞克隆數(shù)(>50個)；計算細胞集落形成率(clony formation rate，CFR)。CFR=克隆數(shù)/細胞接種數(shù)。實驗重復三次，取平均值。形成情況。

1.5.8細胞端粒酶的制備：①收集1×1010個CDC50A+Lin-細胞、CDC50A-Lin-細胞和未分選的宮頸癌原代細胞，置于EP管中；②離心，棄上清；加入裂解緩沖液；③靜置30min后，離心，取上清，用于測定蛋白含量。

1.5.9端粒重復擴增法(Telnefic Repeat Amplification Protoeal，TRAP)結合電泳及銀染法測定端粒酶活性：①根據NCBI數(shù)據庫獲得的資料設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；②50 μl反應體系：10×Buffer(5 μl)，dNTP混合物(4 μl)，TaqDNA聚合酶(2U)，Ts引物(2 μl)，加入適量ddH2O至50 μl?；靹蚝笾糜?0℃水浴中孵育10 min；加入Cx引物2 μl；③95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s，50℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)40次；④取下凝膠，置 10%冰乙酸，40℃固定25 min；加入去離子水清洗；⑤置于40℃ 0.2%硝酸銀溶液中染色20 min；加入去離子水清洗；⑥采用含0.02%甲醛和0.28 mmol/L碳酸鈉顯影液顯影。以未分選的Siha細胞端粒酶活性為1，其他待測標本的端粒酶活性相對強度=待測標本A值/未分選細胞A值。

1.6統(tǒng)計學處理：本資料采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行處理；方差齊性采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，方差不齊采用秩和檢驗；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1流式細胞術檢測結果：宮頸癌原代細胞中表型CDC50A+Lin-的宮頸癌細胞僅占0.95%～5.64%。見圖1。

圖1 7#患者腫瘤組織中提取的原代宮頸癌細胞CDC50A+Lin-死亡流式分析結果

2.2不同組織中CDC50A的表達情況：經免疫組化結果顯示，宮頸癌組織中CDC50A陽性表達率為87.5%，明顯高于正常宮頸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同組織中CDC50A的表達情況[例(%)]

2.3各表型細胞體外增殖情況比較：經MTT法檢測結果顯示，CDC50A+Lin-細胞第5天呈對數(shù)生長，CDC50A-Lin-細胞第7天才出現(xiàn)指數(shù)生長，倍增時間延長，而前者第5天就出現(xiàn)指數(shù)生長的趨勢；對照組未分選原代細胞的生長能力及倍增時間介于前兩者之間。與對照組細胞比較，CDC50A+Lin-細胞的增殖活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 經MTT法檢測各表型細胞體外增殖情況

2.4各表型細胞體內成瘤活性比較：經裸鼠異種移植瘤模型試驗，細胞數(shù)量為1×105-1×107個/ml時，裸鼠皮下接種CDC50A+Lin-細胞，2周就可觀察到明顯的新生腫瘤塊，成瘤率明顯高于接種對照組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而接種CDC50A+Lin-細胞，觀察至12周，仍未見裸鼠形成移植瘤。見表3、見圖2。

表3 不同表型腫瘤細胞裸鼠接種成瘤能力[例(%)]

圖2 裸鼠皮下接種對照組細胞、CDC50A+Lin-細胞和CDC50A-Lin-細胞4周后移植瘤形成情況

2.5集落形成實驗：集落形成實驗結果顯示，培養(yǎng)14 d后，CDC50A+Lin-細胞集落形成率為(0.456±0.131)%顯著高于CDC50A-Lin-細胞集落形成率(0.073±0.04)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.241，P<0.05)。提示CDC50A+Lin-細胞克隆能力明顯高于CDC50A-Lin-細胞。見圖2。

圖2 對照組細胞、CDC50A+Lin-細胞和CDC50A-Lin-細胞培養(yǎng)14 d后細胞集落形成情況

2.6各表型細胞端粒酶活性檢測：未分選的原代宮頸癌細胞端粒酶活性作為對照(相對強度為1)，CDC50A+Lin-細胞端粒酶相對表達強度為4.79±0.78，顯著高于對照組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而CDC50A-Lin-細胞端粒酶相對表達強度為0.46±0.09，顯著低于對照組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A：對照組細胞；B：CDC50A+Lin-細胞；C：CDC50A-Lin-細胞；a與空白對照組比較，P<0.05；b與CDC50A+Lin-細胞比較，P<0.05

3 討論

目前，臨床上關于宮頸癌的治療仍以外科手術切除為主，配合化療和放療輔助治療。有研究認為腫瘤干細胞既是腫瘤細胞放化療耐受的根源所在，也是引起腫瘤細胞轉移和復發(fā)的原因之一，越來越多的婦科領域專家試圖通過尋找干細胞為宮頸癌的治療開辟新的方向[6]。腫瘤干細胞的起源與正常干細胞一樣，都涉及多步驟、多階段、多因素的影響，同樣都保持未分化狀態(tài)，可自我更新和無限增殖[7]。但是不同的是，正常干細胞具有自我更新的反饋調節(jié)機制，增殖和凋亡處于平衡狀態(tài)[8]，但是腫瘤干細胞由于發(fā)生多基因突變導致細胞增殖失控，從而形成腫瘤[9-10]。腫瘤干細胞具有較強的耐藥性和高致瘤性，因此易導致化療失敗。

早在1997年[11]，Bonnet首先自急性粒細胞白血病患者中分離出CD34+CD38-細胞，被證實具有類似造血干細胞特性；但直到2001年[12]，Reya等才正式提出“腫瘤干細胞”的概念。在2003年，Al-Hajj等首先分離出具有自我更新能力、多向分化特性以及高致瘤性的乳腺癌細胞亞型，且這些細胞顯著高表達CD44、CD24和上皮細胞特異性抗原[13]；由此認為CD34+、CD44、CD24可能是腫瘤干細胞的表面標志分子。CD34+、CD44和CD24都屬于細胞黏附分子，廣泛表達于上皮細胞、間質細胞或腫瘤細胞表面，與腫瘤細胞的增殖、分化、遷徙、轉移等惡性生物學行為密切相關。但是目前尚沒有研究確定宮頸癌干細胞表面特異性表達分子。前期有研究通過蛋白組學技術分析認為CDC50A可能是某些CSCs表面標記分子，基于此前提，筆者旨在通過本項研究檢測宮頸癌干細胞表面是否高表達CDC50A。

有研究顯示，宮頸儲備細胞有腫瘤干細胞具有類似的生物學特性，屬于干細胞范疇的一種幼稚多潛能細胞，具有雙向分化潛力[14]。頸管柱狀上皮下的儲備細胞增生和多潛能分化特性是造成宮頸上皮復雜的結構改建和病理變化的基礎，也是造成宮頸癌變的病理基礎[14]。因此，宮頸儲備細胞被認為是宮頸癌細胞的起源[15]。宮頸癌干細胞的分離和鑒定周期較長，本項研究中，筆者首先制備宮頸癌組織原代細胞，待細胞球大量增加后，加入淋巴細胞分離液，去除碎屑雜志。7d后，有部分細胞呈貼壁生長。經流式細胞術篩選后，發(fā)現(xiàn)宮頸癌原代細胞中有少部分CDC50A+Lin-細胞，而正常宮頸原代培養(yǎng)細胞中幾乎未見CDC50A+Lin-細胞。這表明CDC50A可能是宮頸癌干細胞的表面標志物。為了證實此項推論，筆者進一步通過免疫組織化學染色法檢測宮頸癌組織和正常宮頸黏膜組織CDC50A陽性表達情況，結果顯示，宮頸癌組織中CDC50A陽性表達率為87.5%，明顯高于正常宮頸黏膜組織。

腫瘤干細胞的鑒定主要是需要證明它具有干細胞的自我更新、無限增殖及多向分化能力，最重要的是，它是唯一能導致腫瘤發(fā)生的細胞。因此，筆者首先經MTT法證實了CDC50A+Lin-細胞體外增殖活性明顯高于CDC50A-Lin-細胞。并通過接種至裸鼠雙腋下皮下后，觀察腫瘤形成情況，細胞數(shù)量為1×105～1×107個/ml時，裸鼠皮下接種CDC50A+Lin-細胞，2周就可觀察到明顯的新生腫瘤塊，成瘤率明顯高于接種對照組細；而接種CDC50A-Lin-細胞的裸鼠，觀察至12周，仍未見裸鼠形成移植瘤。從而證明了CDC50A+Lin-細胞的成瘤能力。

除此以外，筆者通過TRAP法進一步分析了CDC50A+Lin-細胞和CDC50A-Lin-細胞端粒酶活性。結果顯示，CDC50A+Lin-細胞端粒酶相對表達強度顯著高于對照組細胞和CDC50A-Lin-細胞。端粒酶是由端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)和端粒酶RNA組成的具有特殊逆轉錄活性的核糖核蛋白復合物，其中TERT是端粒酶的催化亞基，只表達于端粒酶陽性細胞中，而端粒酶的陽性表達與癌變的發(fā)生、發(fā)展密切相關。CDC50A+Lin-細胞端粒酶呈高表達，提示，胰腺癌干細胞具有端粒酶活性，它可能通過維持端粒的長度，使細胞保持體外長期傳代、自我更新的生物學特性。

目前，關于腫瘤干細胞的研究在多重實體瘤領域已經取得了較大的進展，但是宮頸癌干細胞的分離和鑒定研究尚少，尤其是干細胞表面標志物尚不明確，因此需要借助其他腫瘤干細胞的研究成果和技術，本項研究采用CDC50A作為宮頸癌干細胞篩選分子也是借鑒以往的文獻報道。通過本項研究對宮頸癌原代細胞分離培養(yǎng)以及表面分子標志物的探索，希望為后續(xù)宮頸癌干細胞的研究提供一定的經驗和理論支持。