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        畜牧場中磺胺類抗生素及其抗性基因的空間分布規(guī)律

        2021-06-17 05:51:54綦崢楊紅張鐵林齊越凌娜
        生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2021年1期
        關(guān)鍵詞:畜牧場磺胺類磺胺

        綦崢,楊紅,張鐵林,齊越,凌娜

        哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心,哈爾濱 150076

        我國每年生產(chǎn)抗生素21萬t,其中48%用于農(nóng)牧業(yè)[1]。畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素高濃度殘留現(xiàn)象已成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題[2]。研究表明,大多數(shù)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素不能被其自身完全吸收,30%~90%的抗生素通過畜禽排泄物或動(dòng)物糞便排出,從而導(dǎo)致了土壤中抗生素殘留的持續(xù)污染[3]。抗生素殘留可誘導(dǎo)抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的產(chǎn)生,通過注射抗生素會(huì)導(dǎo)致其動(dòng)物糞便中抗生素耐藥基因的產(chǎn)生[4]?;前奉惪股?sulfonamides, SAs)在農(nóng)牧業(yè)中的使用量很高,尤其在畜禽糞便中SAs的檢出率也非常高[5]。在江蘇省13個(gè)城市的80份豬場糞便樣本中,磺胺二甲嘧啶(SMD)的檢出率最高,達(dá)到50%以上,磺胺氯噠嗪(SPD)和磺胺嘧啶(SD)檢出率都高于30%,三者的平均殘留量分別為34.0、49.0和69.0 μg·kg-1[6]。殘留的SAs藥物對土壤中的微生物及微生物群落有重要的抑制作用[7]。SAs在牧區(qū)中的普遍使用,將導(dǎo)致耐藥菌和ARGs在土壤環(huán)境中和動(dòng)物之間傳播,從而引起環(huán)境領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[8],同時(shí)ARGs也被公認(rèn)為一種新的污染物[9]。

        為了解畜牧場內(nèi)SAs及ARGs的污染物空間分布情況、分布規(guī)律及相關(guān)性,為畜牧場土壤的修復(fù)提出參考依據(jù),本研究選取大慶市杜爾伯特蒙古自治區(qū)(以下簡稱杜蒙)作為研究對象,該畜牧場位于中國東北黑土地區(qū),東北的黑土地區(qū)是目前世界上珍貴的三大黑土資源之一,以其有機(jī)質(zhì)含量高、土壤肥沃和最適宜耕作而聞名于世,素有“谷物倉庫”之稱[10]。杜蒙地區(qū)擁有眾多大小畜牧場,同時(shí)也是重要的奶源基地。本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對該畜牧場土壤及糞便中的SAs含量及其ARGs豐度進(jìn)行定量檢測,對其空間分布規(guī)律以及SAs對磺胺類ARGs選擇壓力的相似性進(jìn)行分析。

        1 材料與方法(Materials and methods)

        1.1 樣品采集

        杜蒙位于黑龍江省西部,嫩江下游東岸。西鄰泰來縣,南與肇源縣毗鄰,北與齊齊哈爾市接壤[11]。采樣的畜牧場為典型的東北牧區(qū)(圖1)。該地區(qū)氣候?qū)儆跍貛Т箨懶詺夂?,冷暖適中,四季分明。研究區(qū)土地類型上部為黑色腐殖土、黃土和松砂層,下部為灰褐和黑色粘土。底部為灰白、黃灰色砂層和砂礫層,沉積厚度118 cm左右[12]。牧區(qū)總面積約為67 km2,其中畜牧場(存欄量約為200頭),在當(dāng)?shù)貙儆谥行托竽翀觥?/p>

        圖1 杜蒙某畜牧場采樣區(qū)

        在畜牧場采用網(wǎng)格式布設(shè)預(yù)采樣點(diǎn),運(yùn)用荷蘭鉆304不銹鋼土樣采集器,在網(wǎng)格內(nèi)選取土壤采樣點(diǎn)10個(gè)(紅色圓點(diǎn)),采樣深度分別為10 cm和50 cm(圖2),以及糞便樣品5個(gè)(黃色圓點(diǎn))。用GPS定位并記錄,土壤樣品各500 g,在每個(gè)采樣點(diǎn)1 m2內(nèi)取3個(gè)土壤樣品,混勻后待檢測。糞便樣品每份500 g,裝入牛皮紙密封袋中,保存在冰袋中冷藏。

        圖2 現(xiàn)場土壤和糞便采樣分布點(diǎn)

        1.2 樣品檢測

        1.2.1 抗生素檢測方法

        采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS),對土壤中的磺胺類包括磺胺醋酰(SA)、磺胺氯噠嗪(SPD)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲氧嘧啶(SEP)、磺胺脒(SG)、磺胺二甲嘧啶(SMD)、磺胺甲噻二唑(SDS)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺苯吡唑(SPP)、磺胺吡啶(SP)、磺胺噻唑(ST)、磺胺苯酰(SBA)和磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM’)共13種抗生素濃度進(jìn)行檢測。

        稱取1.00 g新鮮土壤樣品(糞便樣品)于10 mL試管中,以EDTA-Mcllvaine緩沖提取液提取3次,渦旋振蕩超聲離心,HLB小柱凈化富集,3 mL甲醇洗脫后,氮吹至近干,1 mL甲醇復(fù)溶震蕩,過0.22 μm有機(jī)系濾膜,經(jīng)LC-MS/MS檢測,色譜和質(zhì)譜條件如表1所示。同時(shí),每組另加2個(gè)全程序空白平行樣,以校正各待測化合物在土壤基質(zhì)中存在的不可忽略的基質(zhì)效應(yīng)。

        表1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)的色譜和質(zhì)譜條件

        1.2.2 抗性基因檢測方法

        (1)DNA提取

        樣品中的基因組提取使用的試劑盒為TIANNAMP Soil DNA Kit(天根生化科技有限公司,中國),按照說明書要求進(jìn)行提取。

        (2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

        測定樣品中3種磺胺類抗性基因sul1、sul2和sul3的多樣性和豐富度,采用試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ測定,qPCR的反應(yīng)體系如表2所示。qPCR的反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,一個(gè)循環(huán)。95 ℃ 5 s,40個(gè)循環(huán)。60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。16S rRNA基因作為內(nèi)參基因。相對豐度的計(jì)算采用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行計(jì)算,其中△CT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)[13]。

        表2 qPCR反應(yīng)體系

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        數(shù)據(jù)通過Excel2016進(jìn)行處理,采用ArcGIS10.5繪制SAs的空間分布規(guī)律圖,Origin8.0對SAs濃度和ARGs相對豐度進(jìn)行分析,利用Cluster3.0和Heatmap繪制熱圖,對SAs和ARGs進(jìn)行聚類分析。

        2 結(jié)果(Results)

        2.1 磺胺類抗生素的空間分布規(guī)律

        13種SAs在糞便及10 cm和50 cm的土層中濃度分布情況(圖3)。整體上,土壤樣品中的濃度分布不均勻,在糞便中,SEP、SMD、SPP、SBA和SDM’的檢出率達(dá)到100%,抗生素的平均濃度為0.060~8.167 μg·kg-1;在10 cm土層中,SPP的檢出率達(dá)到100%,抗生素的平均濃度為0.003~16.097 μg·kg-1;在50 cm土層中,SEP、SBA和SDM的檢出率都達(dá)到100%,抗生素的平均濃度為0.002~6.981 μg·kg-1。其中,SPP是土壤中殘留濃度最高的SAs,SPP在所有被檢測的土壤樣品中的檢出率均高于96.7%,SPP在糞便中的濃度也最高。隨土壤深度增加,SAs殘留濃度減小,SAs在糞便樣品和不同土層的濃度變化趨勢與張昊[14]的研究結(jié)果相似,表明畜牧場土壤中SAs的來源很可能是畜禽糞便在畜牧場內(nèi)的累積造成的。

        圖3 13種磺胺類抗生素(SAs)在糞便和不同深度土壤中的濃度

        土壤中13種SAs的空間分布特征如圖4所示,從污染物空間分布特征來分析可知:從垂直方向上,隨著土壤深度的加深,土壤中SAs的濃度逐漸減小,呈下降趨勢。在水平方向上,10 cm土層中SPP、SA、SG和SBA的空間分布結(jié)構(gòu)相似,從西向東,污染特征呈逐漸減小的趨勢,且主要污染集中在東部地區(qū);SPD、SP和SMZ在10 cm土層的分布結(jié)構(gòu)相似,污染特征主要集中在東北部;50 cm土層中SA、SG、SMZ、SPP、SDM、SD和ST的空間分布結(jié)構(gòu)相似,從西向東污染程度逐漸增大,主要集中在東南部地區(qū);整體水平上SAs在10 cm土層中由西到東空間分布污染情況逐步減小,主要聚集區(qū)域?yàn)樾竽翀龅奈鞑浚?0 cm土層中,從西向東,污染特征逐漸增大,主要污染聚集區(qū)域?yàn)闁|北部地區(qū),其余區(qū)域均無明顯聚集現(xiàn)象。

        圖4 SAs污染的空間分布GIS圖

        2.2 磺胺類ARGs的相對豐度分布情況

        3種磺胺類ARGs在10 cm和50 cm的土層中相對豐度分布情況如圖5所示。整體上,土壤樣品中的相對豐度含量分布不均勻,在10 cm土層中,sul1和sul2的檢出率達(dá)到100%,ARGs的相對豐度范圍為0.0043~0.2282;在50 cm土層中,3種ARGs的檢出率都達(dá)到100%,ARGs的相對豐度范圍為0.0013~0.1499。其中,sul2是土壤中殘留含量最高的磺胺類ARGs,在10 cm土層中的相對豐度含量最高,隨土壤深度增加,磺胺類ARGs相對豐度逐漸減小。這與貴州省養(yǎng)豬場的情況有所不同,在寇宏等[15]的研究中sul3是攜帶率較高的磺胺類ARGs。

        圖5 磺胺類抗生素抗性基因(ARGs)在不同土層中的相對豐度

        2.3 磺胺類抗生素及抗性基因的相關(guān)性分析

        對13種SAs和3種磺胺類ARGs (sul1、sul2和sul3)進(jìn)行聚類分析,熱圖的縱向代表ARGs的相對豐度,橫向代表13種SAs的聚類情況,反映了SAs對磺胺類ARGs是否有選擇壓力的相似性,從圖6可知,SD、SMD、SP和SPP聚為一類,SPD、SEP、SMZ、SA、SDM和SBA聚為一類;SG、SDS和ST聚為一類。說明SD、SMD、SP和SPP對磺胺類ARGs的壓力作用相似;SPD、SEP、SMZ、SA、SDM和SBA對磺胺類ARGs的壓力作用相似;SG、SDS和ST對磺胺類ARGs的壓力作用相似。

        圖6 土壤中SAs及ARGs的聚類分析

        3 討論(Discussion)

        畜牧場土壤中SAs的使用加速了其ARGs的累積,目前ARGs的相對豐度與土壤中的菌群影響研究很多,結(jié)果單一相關(guān)性很低,因此,土壤中ARGs的生成是土壤中微生物、畜牧場中動(dòng)物腸道菌群和土壤性質(zhì)等因素的共同協(xié)作結(jié)果[16]。探究畜牧場土壤中SAs及ARGs的空間分布規(guī)律,為土壤修復(fù)和污染防治提供借鑒。

        SAs在畜牧場土壤中廣泛存在,從空間分布的污染情況可知,垂直方向上,SAs的濃度由上至下逐步升高,其中,SPP的平均濃度最高為8.167 μg·kg-1;水平方向上,10 cm土層和50 cm土層的抗生素整體濃度水平不高,主要聚集在畜牧場的東南部,在畜牧場的西南方向有小部分聚集。西南區(qū)域是成牛的主要活動(dòng)區(qū),東南方向是小牛的主要活動(dòng)區(qū),因此出現(xiàn)了2個(gè)較為明顯的抗生素殘留聚集區(qū)。從SAs濃度的分布情況可知,糞便中SAs的檢測濃度高于土壤中的濃度。這與沈群輝[17]的研究結(jié)果相同,無論是養(yǎng)牛場、養(yǎng)雞場或是養(yǎng)豬場,糞便中SAs的檢測濃度均高于周邊土壤中的濃度。

        結(jié)果表明,抗生素的殘留是導(dǎo)致土壤中磺胺類ARGs產(chǎn)生的主要原因之一,也是潛在ARGs的攜帶者。越來越多的研究表明,過量使用含有抗生素的殘留物會(huì)顯著增加土壤中的ARGs含量??股貧埩袅颗cARGs相對豐度呈顯著相關(guān)性[18-19]。不同的耐藥菌影響了土壤中ARGs的分布和基因相對豐度,從而形成了不同的土壤中抗生素及其ARGs的空間分布特征[20-21]。土壤的性質(zhì)和有機(jī)質(zhì)濃度等環(huán)境因素也會(huì)影響ARGs的分布[22-26]。因此,對SAs及其ARGs在土壤中的危害問題仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究,為今后土壤環(huán)境污染修復(fù)提供參考。

        綜上所述,本研究結(jié)果表明:

        (1)土壤中13種SAs在土壤和糞便樣品中均有檢出,其垂直濃度的空間分布規(guī)律為糞便>10 cm深度土壤>50 cm深度土壤,空間分布污染特征主要集中在畜牧場的東南部。

        (2)土壤中3種ARGs在10 cm和50 cm深度土層中均有檢出,其基因相對豐度分布情況為10 cm深度土壤>50 cm深度土壤,且SAs對ARGs的壓力作用呈現(xiàn)相似性。

        (3)土壤中SAs及其ARGs的空間分布規(guī)律和SAs對ARGs壓力作用的相似性分析,為深入研究畜牧場周邊環(huán)境中ARGs的傳播規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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