陳修才，周世萍，李惠娟，解思達(dá)，熊張平，楊廣斌，朱鑫澤

西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國(guó)家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西南林業(yè)大學(xué))，昆明 650224

農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境質(zhì)量狀況的正確診斷和評(píng)價(jià)，是土壤污染管控修復(fù)，逐步改善土壤環(huán)境質(zhì)量，保持土壤生態(tài)系統(tǒng)良性循環(huán)的重要管理依據(jù)。由于土壤性質(zhì)和污染物種類的復(fù)雜多變，對(duì)土壤環(huán)境健康質(zhì)量的診斷和評(píng)價(jià)，必須同時(shí)考慮土壤微生物、土壤動(dòng)物和植物的異常變化。蚯蚓作為土壤動(dòng)物區(qū)系的代表類群，利用蚯蚓生物標(biāo)志物評(píng)價(jià)污染物對(duì)土壤環(huán)境的危害，從而對(duì)土壤健康質(zhì)量進(jìn)行診斷和評(píng)價(jià)已成為環(huán)境研究領(lǐng)域較受關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一[1-5]。

由于有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯類多數(shù)農(nóng)藥污染物均具有神經(jīng)毒性，污染土壤的神經(jīng)毒性可直接影響蚯蚓等土壤動(dòng)物的神經(jīng)行為狀況，這種神經(jīng)行為變化也可以反映土壤的健康質(zhì)量狀況。與乙酰膽堿酯酶這類神經(jīng)毒性生理生化標(biāo)志物相比，神經(jīng)行為標(biāo)志物的優(yōu)點(diǎn)在于研究過(guò)程中可以對(duì)同一受試動(dòng)物反復(fù)進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)研究可以涵蓋神經(jīng)損傷的開(kāi)始、發(fā)展及恢復(fù)整個(gè)過(guò)程[6]。學(xué)習(xí)行為是動(dòng)物通過(guò)實(shí)踐獲得新信息從而改變之后的行為模式，是一種綜合性的神經(jīng)高級(jí)活動(dòng)。動(dòng)物的學(xué)習(xí)行為受神經(jīng)系統(tǒng)支配，是一項(xiàng)比較敏感的行為指標(biāo)，通過(guò)測(cè)試學(xué)習(xí)行為的功能變化，能夠有效評(píng)價(jià)污染物對(duì)土壤動(dòng)物的神經(jīng)毒性及潛在危害，對(duì)土壤健康質(zhì)量診斷評(píng)價(jià)具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

在動(dòng)物界所有的類群中，從單細(xì)胞動(dòng)物到脊椎動(dòng)物都存在學(xué)習(xí)過(guò)程。雖然蚯蚓的腦容量較小，但研究表明蚯蚓具備一定的學(xué)習(xí)能力。Yerkes[7]首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蚯蚓(Allolobophorafoetida)的學(xué)習(xí)行為，隨后的研究也表明，陸正蚓(Lumbricusterrestris)和赤子愛(ài)勝蚯蚓(Eiseniafoetida)等不同種屬的蚯蚓均具備一定的學(xué)習(xí)能力[8-12]。目前常用的蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)試方法是迷宮實(shí)驗(yàn)，但該方法需要對(duì)蚯蚓進(jìn)行大量訓(xùn)練，耗時(shí)較長(zhǎng)，且訓(xùn)練和測(cè)試過(guò)程容易受蚯蚓分泌物的信息誘導(dǎo)，影響測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]，難以滿足對(duì)土壤健康質(zhì)量進(jìn)行快速有效診斷的要求。有研究表明，蚯蚓對(duì)紅光不敏感，厭惡白光，可以通過(guò)振動(dòng)與白光的配對(duì)刺激誘導(dǎo)蚯蚓的學(xué)習(xí)行為[13]，但如何利用蚯蚓的學(xué)習(xí)行為，對(duì)污染土壤的健康質(zhì)量進(jìn)行快速診斷，目前尚缺乏靈敏有效的測(cè)定方法。

針對(duì)此問(wèn)題，本研究設(shè)計(jì)了一套試驗(yàn)裝置，以紅光作為照明光源，通過(guò)振動(dòng)與白光配對(duì)刺激，對(duì)蚯蚓的學(xué)習(xí)行為進(jìn)行誘導(dǎo)，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了蚯蚓學(xué)習(xí)行為的測(cè)定方法，希望該方法能夠應(yīng)用于土壤神經(jīng)毒性污染物的快速診斷，為農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境健康質(zhì)量的診斷評(píng)價(jià)提供可行的測(cè)定方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置為自制的學(xué)習(xí)行為測(cè)試裝置(圖1)。測(cè)試盒容積為45 cm×45 cm×25 cm。為便于觀察和透氣，測(cè)試盒為單面敞開(kāi)的半封閉式結(jié)構(gòu)，測(cè)試臺(tái)位于測(cè)試盒底部，為模擬蚯蚓在土壤中的移動(dòng)環(huán)境，測(cè)試臺(tái)鋪設(shè)有圓形凸起(凸起高度為0.5 cm；相鄰?fù)蛊瘘c(diǎn)的距離為3 cm)的塑膠墊，塑膠墊面積為40 cm×40 cm；測(cè)試臺(tái)底部設(shè)有振動(dòng)馬達(dá)，振動(dòng)頻率為180 Hz；測(cè)試臺(tái)上方安裝功率均為3 W的紅色燈和白熾燈各1個(gè)，及可以定時(shí)控制的噴霧裝置(噴霧量20 mL·h-1)。其中，白熾燈安裝于箱體頂部的中心位置，距白熾燈安裝位置左右各1 cm處，分別安裝紅色燈和噴霧裝置。安裝后的紅色燈和白色燈距測(cè)試臺(tái)20 cm，測(cè)試時(shí)將蚯蚓放置于測(cè)試臺(tái)的中心位置，紅色燈作為測(cè)試的照明光源，白熾燈提供測(cè)試所需的白光刺激。

圖1 蚯蚓學(xué)習(xí)行為的測(cè)試裝置示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

供試生物為云南紅河地區(qū)采集的皮質(zhì)遠(yuǎn)盲蚓(Amynthascorticis)，培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃；土壤含水量為田間最大持水量60%。挑選2～3月齡，體質(zhì)量0.4～0.5 g，具有成熟環(huán)帶的健康蚯蚓作為實(shí)驗(yàn)蚯蚓。

供試試劑：東莨菪堿(純度>98%)與毒死蜱(純度>98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

供試土壤：土壤采自昆明市官渡區(qū)農(nóng)田2～15 cm耕作層。在采樣地設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn)，取樣后充分混合，得到實(shí)驗(yàn)用土樣。土樣風(fēng)干后過(guò)1 mm篩備用。土壤類型為紅壤，質(zhì)地為粘壤土，pH為6.35，有機(jī)質(zhì)含量為14.75 g·kg-1，陽(yáng)離子交換量為9.8 cmol·kg-1，土壤經(jīng)分析未檢出毒死蜱和東莨菪堿。

1.3 蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定方法建立

蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定在暗室中進(jìn)行。該方法是基于蚯蚓對(duì)白光刺激的厭惡本性，采用自制的測(cè)試裝置，通過(guò)振動(dòng)-白光配對(duì)刺激訓(xùn)練，使蚯蚓學(xué)習(xí)領(lǐng)會(huì)借助加速運(yùn)動(dòng)阻止白光刺激的策略。為實(shí)現(xiàn)上述目的，需要進(jìn)行下列測(cè)試條件優(yōu)化。

1.3.1 移動(dòng)位移閾值確定

移動(dòng)位移閾值是蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定的關(guān)鍵。為了獲得蚯蚓移動(dòng)位移閾值的最佳參數(shù)，在多次預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出可能的蚯蚓移動(dòng)位移閾值6、8、9、10和12 cm，將其設(shè)定為測(cè)試條件，對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。設(shè)置4個(gè)測(cè)試組，每組10條蚯蚓，每次測(cè)試時(shí)，將1條蚯蚓放置于測(cè)試臺(tái)，開(kāi)啟紅色照明燈，適應(yīng)10 min后對(duì)其分別進(jìn)行振動(dòng)、白光刺激各30 s，測(cè)定蚯蚓頭部運(yùn)動(dòng)距離達(dá)到移動(dòng)位移設(shè)定值的次數(shù)，根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算蚯蚓頭部運(yùn)動(dòng)距離達(dá)到移動(dòng)位移閾值的到達(dá)率(A)，計(jì)算公式為：

式中：B為30 s振動(dòng)或光照刺激時(shí)蚯蚓頭部運(yùn)動(dòng)距離達(dá)到各移動(dòng)位移設(shè)定值的次數(shù)；C為30 s振動(dòng)或光照刺激時(shí)蚯蚓頭部運(yùn)動(dòng)距離達(dá)到各移動(dòng)位移設(shè)定值的次數(shù)總和。

1.3.2 蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定條件優(yōu)化

對(duì)蚯蚓的學(xué)習(xí)行為測(cè)定是通過(guò)30 s振動(dòng)與30 s白光配對(duì)刺激進(jìn)行，在多次預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)影響蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定的條件主要有休息恢復(fù)時(shí)間和學(xué)習(xí)周期，需要對(duì)這2個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

(1)休息恢復(fù)時(shí)間

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出可能的休息恢復(fù)時(shí)間為6、7、8、9和10 min，將其分別設(shè)定為休息恢復(fù)條件，每個(gè)條件設(shè)4個(gè)重復(fù)組，每組10條蚯蚓，對(duì)其進(jìn)行條件優(yōu)化。測(cè)試時(shí)，將1條蚯蚓放置于測(cè)試臺(tái)，開(kāi)啟紅色照明燈，適應(yīng)10 min后對(duì)其進(jìn)行包括30 s振動(dòng)/30 s白光/30 s振動(dòng)/30 s白光/30 s振動(dòng)/30 s白光的1個(gè)周期學(xué)習(xí)測(cè)試。測(cè)試期間對(duì)蚯蚓的移動(dòng)進(jìn)行監(jiān)控，如振動(dòng)刺激期間，蚯蚓頭部運(yùn)動(dòng)距離達(dá)到或超過(guò)移動(dòng)位移閾值，則隨后的白光刺激不出現(xiàn)，但振動(dòng)刺激仍然持續(xù)；如白光刺激期間，蚯蚓頭部運(yùn)動(dòng)移動(dòng)達(dá)到或超過(guò)移動(dòng)位移閾值，則立即關(guān)閉照明燈，停止白光刺激，待下一個(gè)振動(dòng)刺激開(kāi)始時(shí)繼續(xù)進(jìn)行循環(huán)刺激學(xué)習(xí)。分別測(cè)定每次振動(dòng)和白光刺激時(shí)，蚯蚓頭部運(yùn)動(dòng)距離達(dá)到或超過(guò)移動(dòng)位移閾值的所需時(shí)間；學(xué)習(xí)結(jié)束后按照設(shè)置的休息條件進(jìn)行恢復(fù)，再對(duì)蚯蚓進(jìn)行學(xué)習(xí)測(cè)試(測(cè)試條件同上)。

(2)學(xué)習(xí)周期

每個(gè)學(xué)習(xí)周期包括30 s振動(dòng)/30 s白光/30 s振動(dòng)/30 s白光/30 s振動(dòng)/30 s白光，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出1、2、3和4個(gè)學(xué)習(xí)周期作為學(xué)習(xí)條件，每個(gè)條件設(shè)4個(gè)重復(fù)組，每組10條蚯蚓。每個(gè)學(xué)習(xí)周期結(jié)束后，應(yīng)按照(1)優(yōu)化的休息恢復(fù)時(shí)間，讓蚯蚓進(jìn)行休息恢復(fù)后再進(jìn)行下一周期的學(xué)習(xí)。休息期內(nèi)關(guān)閉振動(dòng)及白光，打開(kāi)噴霧器進(jìn)行噴霧待休息結(jié)束關(guān)閉。分別測(cè)定各訓(xùn)練周期內(nèi)蚯蚓每次振動(dòng)和光照刺激期間，頭部運(yùn)動(dòng)距離達(dá)到或超過(guò)移動(dòng)位移閾值的所需時(shí)間，根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)，對(duì)學(xué)習(xí)周期進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 蚯蚓的學(xué)習(xí)行為測(cè)定

東莨菪堿是動(dòng)物學(xué)習(xí)障礙模型造模的代表藥物[13]，因此，利用東莨菪堿和具有神經(jīng)毒性的毒死蜱農(nóng)藥[14]對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了驗(yàn)證。在蚯蚓未表現(xiàn)出回避反應(yīng)的濃度范圍內(nèi)分別設(shè)置3個(gè)濃度梯度：東莨菪堿處理組(1、2和3 mg·kg-1)、毒死蜱處理組(4、8和12 mg·kg-1)，按照實(shí)驗(yàn)土壤設(shè)計(jì)濃度計(jì)算東莨菪堿需要量，準(zhǔn)確稱量后將所需試劑用丙酮溶解后，攪拌混勻于20 g土壤中，待丙酮完全揮發(fā)后(無(wú)丙酮?dú)馕?再與480 g土壤混勻，放入500 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入蒸餾水將土壤含水量調(diào)節(jié)為土壤田間最大持水量的60%。將清腸處理后的蚯蚓隨機(jī)放入東莨菪堿處理和毒死蜱各濃度處理組中，每組放入10條蚯蚓，以保鮮膜封口(預(yù)留換氣孔)。在溫度為24 ℃、濕度為60%條件下培養(yǎng)，以丙酮空白為對(duì)照組，每個(gè)濃度及對(duì)照設(shè)4個(gè)重復(fù)。染毒處理1 d后取出蚯蚓，采用本研究的測(cè)試裝置及建立的蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定方法，對(duì)蚯蚓的學(xué)習(xí)行為進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SSPS 13.0軟件(SPSS Inc.)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SD的形式表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 蚯蚓移動(dòng)位移閾值確定

蚯蚓到達(dá)不同移動(dòng)位移設(shè)定閾值的到達(dá)率(A)如圖2所示，振動(dòng)和白光刺激條件下，A均隨著閾值設(shè)定值的增加而下降；相同設(shè)定閾值條件下，白光刺激條件下的A值均高于振動(dòng)刺激的到達(dá)率，當(dāng)設(shè)定閾值為9 cm時(shí)，白光刺激條件下蚯蚓的A值顯著高于振動(dòng)刺激條件下的A值(P<0.05)，而其他設(shè)定閾值條件下，白光刺激時(shí)蚯蚓A值與振動(dòng)刺激的A值均不存在顯著差異(P>0.05)，但設(shè)定閾值達(dá)到或超過(guò)10 cm時(shí)，蚯蚓在振動(dòng)和白光刺激條件下的A值均呈現(xiàn)顯著下降，原因可能與此閾值設(shè)定過(guò)高，振動(dòng)或白光刺激時(shí)蚯蚓移動(dòng)均難以達(dá)到有關(guān)。本研究選擇移動(dòng)位移設(shè)定值9 cm作為移動(dòng)位移閾值。

圖2 不同移動(dòng)設(shè)定閾值對(duì)蚯蚓到達(dá)率(A)的影響

2.2 休息恢復(fù)時(shí)間對(duì)蚯蚓學(xué)習(xí)行為的影響

不同休息恢復(fù)時(shí)間對(duì)蚯蚓的學(xué)習(xí)影響如圖3所示，恢復(fù)時(shí)間為5～6 min，休息恢復(fù)后蚯蚓學(xué)習(xí)測(cè)試的到達(dá)移動(dòng)位移閾值時(shí)間，顯著高于恢復(fù)前學(xué)習(xí)測(cè)試的到達(dá)位移閾值時(shí)間(P<0.05)；恢復(fù)時(shí)間為7～9 min，休息恢復(fù)后蚯蚓學(xué)習(xí)測(cè)試的到達(dá)位移閾值時(shí)間，與恢復(fù)前蚯蚓學(xué)習(xí)測(cè)試的到達(dá)位移閾值時(shí)間并無(wú)顯著差異(P﹥0.05)，表明蚯蚓經(jīng)過(guò)7～9 min的休息后，體力已基本恢復(fù)，本研究選擇7 min作為蚯蚓的休息恢復(fù)時(shí)間。

圖3 不同休息恢復(fù)時(shí)間對(duì)蚯蚓學(xué)習(xí)行為的影響

2.3 學(xué)習(xí)周期對(duì)蚯蚓學(xué)習(xí)行為的影響

不同學(xué)習(xí)訓(xùn)練周期對(duì)蚯蚓學(xué)習(xí)行為的影響如圖4所示。隨著學(xué)習(xí)訓(xùn)練周期增加，蚯蚓的移動(dòng)速度加快，到達(dá)移動(dòng)位移閾值的時(shí)間不斷縮短，當(dāng)學(xué)習(xí)訓(xùn)練達(dá)到3個(gè)周期時(shí)，蚯蚓到達(dá)移動(dòng)位移閾值的時(shí)間已顯著低于訓(xùn)練1～2個(gè)周期的到達(dá)移動(dòng)位移閾值時(shí)間(P<0.05)，但學(xué)習(xí)訓(xùn)練3個(gè)周期后，蚯蚓到達(dá)移動(dòng)位移閾值的時(shí)間已基本穩(wěn)定，與學(xué)習(xí)訓(xùn)練4個(gè)周期的蚯蚓到達(dá)移動(dòng)位移閾值時(shí)間無(wú)顯著差異(P﹥0.05)，本研究選擇3個(gè)訓(xùn)練周期作為蚯蚓的學(xué)習(xí)訓(xùn)練條件。

圖4 不同學(xué)習(xí)周期對(duì)蚯蚓學(xué)習(xí)行為的影響

2.4 蚯蚓的學(xué)習(xí)行為測(cè)定

采用本研究建立的蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定方法，對(duì)東莨菪堿和毒死蜱暴露1 d后的蚯蚓學(xué)習(xí)行為進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。東莨菪堿和毒死蜱不同暴露濃度組中蚯蚓到達(dá)移動(dòng)閾值的時(shí)間均顯著高于對(duì)照組，隨著東莨菪堿和毒死蜱暴露濃度的增加，蚯蚓到達(dá)移動(dòng)閾值的時(shí)間顯著增加，表明東莨菪堿和毒死蜱處理均導(dǎo)致了蚯蚓的學(xué)習(xí)能力下降，暴露濃度越高，對(duì)蚯蚓的學(xué)習(xí)行為損傷越嚴(yán)重。

圖5 不同污染處理對(duì)蚯蚓學(xué)習(xí)行為的影響

3 討論(Discussion)

污染物的毒性可直接影響土壤動(dòng)物的行為，這種行為變化對(duì)污染物的毒性具有指示作用，因此可以通過(guò)土壤動(dòng)物的行為變化來(lái)監(jiān)測(cè)、評(píng)價(jià)污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。學(xué)習(xí)行為是動(dòng)物借助于個(gè)體生活經(jīng)歷和經(jīng)驗(yàn)使自身的行為發(fā)生適應(yīng)性變化的過(guò)程，是一種綜合性的神經(jīng)高級(jí)活動(dòng)，對(duì)土壤污染物神經(jīng)毒性的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)具有重要價(jià)值，但由于缺乏蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定的有效方法，在土壤生態(tài)毒性的監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)中應(yīng)用較少。

目前動(dòng)物學(xué)習(xí)行為的測(cè)定主要采用迷宮實(shí)驗(yàn)方法[15-19]，這種測(cè)定方法主要測(cè)試的是動(dòng)物的空間識(shí)別學(xué)習(xí)能力。采用這種方法對(duì)蚯蚓進(jìn)行學(xué)習(xí)行為測(cè)試時(shí)，由于測(cè)試過(guò)程中蚯蚓會(huì)產(chǎn)生分泌物，蚯蚓在空間識(shí)別學(xué)習(xí)時(shí)會(huì)受到分泌物的信息干擾，需要對(duì)測(cè)試裝置及時(shí)進(jìn)行清理，否則會(huì)影響測(cè)試的準(zhǔn)確性[12]。本研究建立的蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)試方法是基于蚯蚓厭惡白光刺激的特性，采用振動(dòng)與白光配對(duì)刺激對(duì)蚯蚓進(jìn)行學(xué)習(xí)測(cè)試。學(xué)習(xí)過(guò)程中當(dāng)蚯蚓移動(dòng)加快，移動(dòng)位移達(dá)到或超過(guò)移動(dòng)閾值時(shí)，就不出現(xiàn)或停止白光刺激，如未達(dá)到移動(dòng)閾值，則出現(xiàn)或繼續(xù)白光刺激。通過(guò)振動(dòng)、白光刺激的交替循環(huán)學(xué)習(xí)訓(xùn)練，使蚯蚓領(lǐng)會(huì)可以借助加速運(yùn)動(dòng)阻止白光刺激的策略。如蚯蚓通過(guò)學(xué)習(xí)已領(lǐng)會(huì)此策略，則在振動(dòng)和白光刺激時(shí)，蚯蚓將會(huì)加快移動(dòng)來(lái)阻止白光刺激，通過(guò)對(duì)其達(dá)到移動(dòng)閾值的時(shí)間測(cè)定，就可以反映蚯蚓的學(xué)習(xí)行為變化，因此對(duì)蚯蚓的學(xué)習(xí)行為測(cè)試不受蚯蚓分泌物干擾的影響。

蚯蚓移動(dòng)位移閾值是蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)定能否有效的關(guān)鍵。移動(dòng)位移閾值設(shè)置過(guò)低，蚯蚓在振動(dòng)刺激期間就能輕易達(dá)到，會(huì)導(dǎo)致蚯蚓難以進(jìn)入隨后的白光刺激學(xué)習(xí)；移動(dòng)位移閾值設(shè)置過(guò)高，則蚯蚓在振動(dòng)和白光刺激學(xué)習(xí)期間，因難以達(dá)到移動(dòng)位移閾值，而不能領(lǐng)會(huì)可以通過(guò)加速移動(dòng)阻止白光刺激的策略。移動(dòng)位移閾值應(yīng)是蚯蚓應(yīng)激狀態(tài)下能夠達(dá)到的移動(dòng)閾值，這樣蚯蚓才能通過(guò)學(xué)習(xí)，領(lǐng)會(huì)加速移動(dòng)阻止白光刺激的策略。

本研究的結(jié)果表明，當(dāng)移動(dòng)位移閾值設(shè)定為6～8 cm時(shí)，不同刺激條件下蚯蚓到達(dá)不同設(shè)定值的到達(dá)率并無(wú)顯著差異(P﹥0.05)(圖2)，說(shuō)明設(shè)定值過(guò)低，蚯蚓在振動(dòng)刺激期間就能輕易達(dá)到；而當(dāng)移動(dòng)位移閾值設(shè)定為10～12 cm時(shí)，振動(dòng)刺激條件下蚯蚓到達(dá)不同設(shè)定值的到達(dá)率為2.2%～22.2%(圖2)，白光刺激條件下蚯蚓到達(dá)不同設(shè)定值的到達(dá)率為5.8%～25.8%(圖2)，表明此閾值設(shè)定過(guò)高，振動(dòng)或白光刺激時(shí)蚯蚓移動(dòng)均難以達(dá)到設(shè)定值；當(dāng)蚯蚓移動(dòng)位移閾值設(shè)定為9 cm時(shí)，振動(dòng)刺激時(shí)蚯蚓到達(dá)設(shè)定值的到達(dá)率顯著低于白光刺激的到達(dá)率(P<0.05)，說(shuō)明9 cm的移動(dòng)位移設(shè)定值是蚯蚓在應(yīng)激狀態(tài)下能夠達(dá)到的移動(dòng)閾值。

由于蚯蚓學(xué)習(xí)過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)消耗較大，每個(gè)學(xué)習(xí)周期結(jié)束后應(yīng)讓蚯蚓進(jìn)行休息恢復(fù)。本研究中，休息恢復(fù)時(shí)間為5～6 min，休息后學(xué)習(xí)測(cè)試的蚯蚓到達(dá)移動(dòng)位移閾值時(shí)間，顯著大于恢復(fù)前學(xué)習(xí)測(cè)試的蚯蚓到達(dá)移動(dòng)位移閾值時(shí)間(P<0.05)，這可能是由于休息時(shí)間不夠，蚯蚓的運(yùn)動(dòng)消耗未能恢復(fù)，而導(dǎo)致測(cè)定時(shí)移動(dòng)能力下降；休息時(shí)間為7～9 min，休息后蚯蚓學(xué)習(xí)測(cè)試的到達(dá)移動(dòng)位移閾值時(shí)間，與休息前的到達(dá)時(shí)間并無(wú)顯著差異(P﹥0.05)，表明蚯蚓經(jīng)過(guò)7～9 min的休息后，運(yùn)動(dòng)消耗已基本恢復(fù)，能夠進(jìn)行下一周期的學(xué)習(xí)測(cè)試。

與迷宮實(shí)驗(yàn)相比，本研究建立的蚯蚓學(xué)習(xí)行為測(cè)試裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，測(cè)試方案蚯蚓易于領(lǐng)會(huì)。當(dāng)學(xué)習(xí)訓(xùn)練達(dá)到3個(gè)周期時(shí)，蚯蚓到達(dá)移動(dòng)位移閾值的時(shí)間已顯著低于訓(xùn)練1～2個(gè)周期的到達(dá)移動(dòng)位移閾值時(shí)間(P<0.05)，說(shuō)明蚯蚓經(jīng)過(guò)3個(gè)周期的學(xué)習(xí)訓(xùn)練后已能領(lǐng)會(huì)到借助加速運(yùn)動(dòng)阻止白光刺激的策略，而采用迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)蚯蚓進(jìn)行學(xué)習(xí)行為測(cè)試，一般需要對(duì)蚯蚓進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的多次重復(fù)訓(xùn)練[8-12]。李力和潘雷[11]對(duì)蚯蚓(Eiseniafoetida)學(xué)習(xí)行為的迷宮實(shí)驗(yàn)表明，蚯蚓需要80次以上的訓(xùn)練，才能進(jìn)行學(xué)習(xí)測(cè)定，迷宮設(shè)置越難，需要的訓(xùn)練次數(shù)就越多。

為了驗(yàn)證本研究的裝置及方法對(duì)蚯蚓學(xué)習(xí)行為的測(cè)試是否有效，筆者采用東莨菪堿和毒死蜱污染土壤對(duì)蚯蚓進(jìn)行染毒處理，對(duì)染毒后的蚯蚓進(jìn)行學(xué)習(xí)測(cè)試。東莨菪堿是常用的動(dòng)物學(xué)習(xí)障礙模型造模藥物，可以阻斷大腦皮質(zhì)、隔區(qū)及海馬結(jié)構(gòu)的乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)障礙[13]。毒死蜱不僅具有神經(jīng)毒性，而且是目前我國(guó)廣泛使用且土壤污染較為嚴(yán)重的有機(jī)磷農(nóng)藥品種[20-23]，有研究表明，毒死蜱會(huì)造成動(dòng)物的神經(jīng)元損傷和學(xué)習(xí)障礙[24]。本研究的測(cè)試結(jié)果表明，東莨菪堿和毒死蜱污染暴露均導(dǎo)致了蚯蚓的學(xué)習(xí)障礙，且污染濃度越高，對(duì)蚯蚓的學(xué)習(xí)行為損傷越嚴(yán)重，應(yīng)用本研究建立的測(cè)試方法，染毒1 d后即可檢測(cè)到蚯蚓學(xué)習(xí)行為的變化。與利用半致死濃度(LC50)等常用的毒理學(xué)檢測(cè)方法相比，不僅檢測(cè)靈敏度大大提高，而且短期暴露后就可以檢測(cè)，有望用于低濃度神經(jīng)毒性農(nóng)藥污染土壤的神經(jīng)毒性快速診斷。由于本研究采用的實(shí)驗(yàn)生物為皮質(zhì)遠(yuǎn)盲蚓，未對(duì)其他品種的蚯蚓學(xué)習(xí)行為進(jìn)行深入研究，考慮到不同品種的蚯蚓學(xué)習(xí)行為能力可能存在差異，該方法是否適合其他蚯蚓品種對(duì)低濃度神經(jīng)毒性污染物污染土壤的毒性檢測(cè)，還有待進(jìn)一步研究，今后應(yīng)加強(qiáng)此方面的研究工作。