林慧嬌，張馨蕓，劉嘉瑋，苑麗葳，劉佳樂，王春梅，孫靖輝，陳建光，李 賀，敬 舒

（1.北華大學藥學院藥理教研室，吉林吉林 132013；2.吉林市中心醫(yī)院，吉林吉林 132013；3.北華大學附屬醫(yī)院，吉林吉林 132013）

南五味子是華中五味子（木蘭科植物）的成熟干燥果實，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已經(jīng)記載了關于南五味子對久咳虛喘、盜汗遺精、久瀉不止、津傷口渴、失眠多夢癥狀的功能主治，應用歷史悠久[1]。在2002年，衛(wèi)生部公布的《關于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》中將五味子列入可作為保健食品名單[2]。隨著現(xiàn)代藥理學研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)南五味子提取物具有鎮(zhèn)靜催眠[3]、抗衰老[4]、抑菌[5]、保肝[6]等多種功效，其中的木脂素類成分在多種類型的肝損傷中發(fā)揮改善作用[7]。因此，南五味子是藥物和保健食品的理想原料。安五脂素（Anwulignan，Anwu）是南五味子木脂素單體化合物成分之一，已引起越來越多的關注和研究。團隊前期研究發(fā)現(xiàn)安五脂素具有較強的抗氧化作用，能夠保護衰老小鼠的肝損傷[8]。本研究擬探討安五脂素對其它類型的肝損傷是否也具有保護作用。

腸缺血再灌注（Intestinal ischemia-reperfusion，II/R）是常見的一種消化系統(tǒng)疾病。在急性腸梗阻、創(chuàng)傷、休克、腸套疊、急性腸系膜動脈栓塞等過程中均有發(fā)生，具有高發(fā)病率及高死亡率的特點[9]。缺血再灌注過程中缺血缺氧將導致機體經(jīng)由黃嘌呤氧化酶途徑過度產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可引起缺血器官及其它器官即遠隔器官的損傷[10]。肝臟因其血液循環(huán)特點，更容易受到腸缺血再灌注過程中產(chǎn)生的ROS影響[11]。因此，減少自由基產(chǎn)生及加快其消除是防治缺血再灌損傷的重要途徑。本研究通過建立腸缺血再灌注模型，檢測血清ALT及AST活性，HE染色觀察肝組織損傷情況，結合肝組織中氧化相關指標水平，探究Anwulignan在腸缺血再灌注模型中對肝組織的保護作用，以期為開發(fā)五味子用于改善肝損傷的保健食品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠（225～250 g） 長春市億斯實驗動物技術有限責任公司（實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（吉）-2016-0003）；安五脂素 四川省維克奇生物科技有限公司；谷丙轉氨酶（Alanine transaminase,ALT）檢測試劑盒、谷草轉氨酶（Aspartate transaminase, AST）檢測試劑盒、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、蛋白激酶C（Protein kinase C, PKC）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）檢測試劑盒、過氧化氫酶（Catalase, CAT）檢測試劑盒、谷胱甘肽-S-轉移酶（Glutathione S-transferase, GST）檢測試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）檢測試劑盒、8-羥基脫氧鳥苷（8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine, 8-OHdG）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Infinite M200全自動酶標儀 瑞士TECAN集團公司；超低溫冰箱（-80 ℃） 日本 SANY 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、給藥及模型建立 將SD大鼠隨機分為四組：即假手術組（Sham組，羧甲基纖維素鈉灌胃 + 假手術），缺血再灌注組（II/R組，羧甲基纖維素鈉灌胃+II/R），假手術+Anwulignan組（Sham+Anwu組，Anwulignan 7 mg/kg灌胃+假手術）及缺血再灌注+Anwulignan組（II/R+Anwu組，Anwulignan 7 mg/kg 灌胃+II/R）。各組給予羧甲基纖維素鈉或Anwulignan灌胃，每天一次，連續(xù)14 d。末次給藥60 min后，Sham組及Sham+Anwu組給予假手術，即大鼠僅進行剖腹手術處理，不夾閉腸系膜上動脈；而II/R組及II/R + Anwu組進行II/R，即剖腹后夾閉腸系膜上動脈45 min，再灌注60 min。造模結束后經(jīng)腹主動脈取血，室溫靜置30 min，在-20 ℃下，3000 r/min離心10 min獲得大鼠血清，-80 ℃保存，并摘取大鼠肝臟備用。

1.2.2 大鼠血清ALT、AST活性的檢測 取大鼠血清，按試劑盒說明檢測血清中ALT、AST的活性。

1.2.3 肝組織病理變化 取各組大鼠肝臟，用10%中性甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚5 μm），HE染色。光鏡下觀察肝組織結構變化。

1.2.4 大鼠肝ROS及PKC含量的檢測 大鼠肝臟樣本經(jīng)生理鹽水漂洗后，吸干水分，與生理鹽水1:9比例冰浴勻漿后，得10倍的組織勻漿，在-20 ℃下，3000 r/min離心10 min得上清液，按試劑盒說明檢測肝ROS及PKC含量。

1.2.5 大鼠肝SOD、CAT、GST活性及MDA、8-OHdG含量的檢測 將大鼠肝組織與生理鹽水按1:9比例冰浴勻漿后，在-20 ℃下，3000 r/min離心10 min得上清液，按試劑盒說明檢測大鼠肝SOD、CAT、GST活性及MDA、8-OHdG含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，單因素方差分析進行顯著性檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 安五脂素對大鼠血清轉氨酶活性的影響

ALT主要分布于肝細胞胞漿中，而AST主要分布于肝細胞線粒體內(nèi)。正常生理狀態(tài)下，血液中只存在微量的ALT及AST[12]。當肝組織發(fā)生損傷，ALT及AST因細胞膜通透性升高而進入血液。因此在臨床或實驗中，血清ALT及AST活性可作為反映肝損傷程度的指標[13-14]。如圖1所示，與Sham組比較，II/R組大鼠血清ALT及AST活性極顯著升高（P＜0.01），Sham+Anwu組大鼠血清ALT及AST活性未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；與II/R組比較，II/R+Anwu組大鼠血清ALT活性顯著降低（P＜0.05），AST活性極顯著降低（P＜0.01）。這些結果反映安五脂素能夠減輕腸缺血再灌注引起的肝臟細胞損傷。

2.2 安五脂素對大鼠肝組織病理學變化的影響

HE染色（圖2）顯示，Sham組大鼠肝索排列整齊，呈放射狀圍繞中央靜脈分布，組織結構沒有明顯變化。II/R組大鼠肝索排列紊亂沒有規(guī)則，肝細胞明顯水腫，胞漿疏松淡染，肝血竇受擠壓變窄，肝組織出現(xiàn)局部灶狀壞死，可見炎細胞浸潤。Sham+Anwu組大鼠肝索排列整齊，呈放射狀圍繞中央靜脈分布，無肝竇淤血，無肝細胞變性及壞死。II/R+Anwu組大鼠肝索排列整齊，未見肝細胞水腫，偶見肝細胞點狀壞死，無淤血。表明安五脂素能夠一定程度上減輕腸缺血再灌注引起的肝臟細胞損傷。

圖1 安五脂素對大鼠血清ALT及AST活性的影響（n=6）Fig.1 Effect of anwulignan on serum ALT and AST activities in rats（n=6）

圖2 安五脂素對腸缺血再灌注大鼠肝組織病理變化的影響（200×，400×）Fig.2 Effects of anwulignan on the pathological changes of liver tissue in rats with intestinal ischemia-reperfusion(200×，400×)

2.3 安五脂素對大鼠肝組織中氧化相關指標的影響

2.3.1 安五脂素對大鼠肝ROS含量的影響 在缺血過程中，組織局部缺氧，ROS經(jīng)由黃嘌呤途徑大量生成，在體內(nèi)可通過脂質過氧化反應、蛋白氧化失活以及DNA斷裂等途徑損害脂質、蛋白質以及核酸等生物大分子的生理結構及功能，使機體細胞、組織及器官因氧化損傷而發(fā)生病變[15]。缺血再灌注導致ROS的大量生成，是造成遠隔器官損傷的主要因素[16-17]。本研究大鼠肝ROS水平檢測結果如圖3A所示，與Sham組比較，II/R組大鼠肝ROS活性極顯著升高（P＜0.01），而Sham+Anwu組大鼠肝ROS含量未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；而與II/R組比較，II/R+Anwu組大鼠肝ROS含量的水平顯著降低（P＜0.05）。表明安五脂素能夠對抗自由基，具有抗氧化的作用。

2.3.2 安五脂素對大鼠肝PKC含量的影響 PKC是一種激酶，在多個細胞信號轉導途徑中發(fā)揮關鍵作用[18]。PKC由ROS活化后，參與激活NF-κB、MAPK等炎癥信號通路，導致機體出現(xiàn)更嚴重的損傷[19]。而活化的PKC還可通過NADPH氧化酶途徑促進ROS的生成[20-22]。二者相互促進，對機體造成更嚴重的損害。本研究大鼠肝組織PKC含量檢測結果如圖3B所示，與Sham組比較，II/R組大鼠肝PKC含量顯著升高（P＜0.05），而Sham+Anwu組大鼠肝PKC含量未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；而與II/R組比較，II/R+Anwu組大鼠肝PKC含量顯著降低（P＜0.05）。由此說明安五脂素可能通過干預PKC的含量，減少氧化應激及炎癥反應的發(fā)生。

2.3.3 安五脂素對大鼠肝SOD活性的影響 SOD是最主要的內(nèi)源性抗氧化酶之一，能夠清除缺血再灌注過程中產(chǎn)生的氧自由基，抵抗氧化應激損傷[23]。如圖4A所示，與Sham組比較，II/R組大鼠肝SOD活性極顯著降低（P＜0.01），而Sham+Anwu組大鼠肝SOD活性未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；與II/R組比較，II/R+Anwu組大鼠肝SOD活性極顯著升高（P＜0.01）。以上結果表明安五脂素通過提高SOD活性而發(fā)揮清除ROS的作用。

2.3.4 安五脂素對大鼠肝CAT活性的影響 CAT屬于酶類抗氧化劑，其作用是代謝體內(nèi)過氧化氫為水及分子氧[23]。本研究大鼠肝CAT活性檢測結果如圖4B所示，與Sham組比較，II/R組大鼠肝CAT活性顯著降低（P＜0.05），而Sham+Anwu組大鼠肝CAT活性未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；與II/R組比較，II/R+Anwu組大鼠肝CAT活性極顯著升高（P＜0.01）。提示安五脂素也可通過提高CAT活性而發(fā)揮抗氧化作用。

2.3.5 安五脂素對大鼠肝GST活性的影響 GST是具有肝臟解毒功能及清除過氧化物雙重作用的一種酶。它在肝臟內(nèi)中高表達，能催化細胞內(nèi)的谷胱甘肽與多種親電子底物結合，代謝體內(nèi)的ROS以免受氧化應激損傷[24-25]。如圖4C所示，與Sham組比較，II/R組大鼠肝GST活性極顯著降低（P＜0.01），而Sham+Anwu組大鼠肝GST活性未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）；與II/R組比較，II/R+Anwu組大鼠肝GST活性極顯著升高（P＜0.01）。提示安五脂素可通過提高GST活性，促進谷胱甘肽清除缺血再灌注過程產(chǎn)生的有害物質，從而保護肝組織免受氧化損傷。

2.3.6 安五脂素對大鼠肝MDA含量的影響 ROS攻擊位于細胞膜上不飽和脂肪酸而生成脂質過氧化產(chǎn)物MDA，因此其含量能夠反映機體的氧化損傷程度[26]。如圖4D所示，與Sham組比較，II/R組大鼠肝MDA含量極顯著升高（P＜0.01），而Sham+Anwu組大鼠肝MDA含量無顯著變化（P＞0.05）；與II/R組比較，II/R+Anwu組大鼠肝MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。提示安五脂素減輕了腸缺血再灌注大鼠肝細胞膜的氧化損傷，這可能是有效阻止肝ALT及AST入血，使血清ALT、AST水平降低的原因之一。

圖3 安五脂素對大鼠肝ROS及PKC含量的影響（n = 6）Fig.3 The effect of anwulignan on liver ROS and PKC contents levels in rats（n = 6）

2.3.7 安五脂素對大鼠肝8-OHdG含量的影響 8-OHdG是DNA氧化損傷的常用指標[27]。當DNA受到ROS攻擊時，脫氧鳥苷被轉化為8-OHdG，使DNA中的堿基不能正常配對，導致基因缺失突變，其含量越高，表示DNA氧化損傷越嚴重[28]。在多種由ROS引起的病變中，如糖尿病、癌癥、心血管疾病、缺血再灌注損傷，均可見8-OHdG的含量顯著升高[29-31]。腸缺血再灌注導致ROS的大量生成，是II/R致遠端器官損傷的主要機制之一，因此本研究選取8-OHdG進行檢測，結果如圖4E所示，與Sham組比較，II/R組大鼠肝8-OHdG含量極顯著升高（P＜0.01），而Sham+Anwu組大鼠肝8-OHdG含量無顯著變化（P＞0.05）；與II/R組比較，I/R+Anwu組大鼠肝8-OHdG含量極顯著降低（P＜0.01）。提示安五脂素降低了8-OHdG含量，從而反映出腸缺血再灌注后肝組織中DNA的氧化損傷程度減輕，這可能是安五脂素發(fā)揮對肝組織的保護作用的機制之一。

圖4 安五脂素對大鼠肝SOD、CAT、GST活性以及MDA、8-OHdG含量的影響（n = 6）Fig.4 The effect of anwulignan on liver SOD, CAT, GST activities and MDA, 8-OHdG contents in rats（n = 6）

3 討論與結論

研究表明，腸缺血再灌注會產(chǎn)生大量的ROS，引起組織細胞氧化應激，這不僅會損傷腸道本身，還會影響到遠隔組織器官，對機體產(chǎn)生廣泛而極大的危害[32-33]。因此研發(fā)能夠改善II/R所致的遠隔組織器官損傷的藥物及保健食品具有重要的臨床意義。肝臟是人體最大的解毒器官，門靜脈血供應占整個肝臟血供的3/4，腸系膜上、下靜脈是門靜脈的重要屬支。由于肝臟直接接受小腸靜脈回流的血液，使得腸缺血再灌注過程中產(chǎn)生的毒性物質，會直接進入并攻擊肝臟。本研究結果顯示，大鼠腸缺血再灌注使大鼠血清ALT、AST水平極顯著升高（P＜0.01），肝組織形態(tài)發(fā)生病理學改變，肝組織ROS、MDA及8-OHdG等水平極顯著提升（P＜0.01），提示肝組織受損。

安五脂素是傳統(tǒng)中藥南五味子中活性成分木脂素的特征性組分[34]，本研究結果顯示安五脂素能夠顯著降低腸缺血再灌注所致大鼠血清ALT 水平（P＜0.05）、AST水平（P＜0.01），并且肝組織結構損傷得到顯著性的改善，提示安五脂素對大鼠腸缺血再灌注致遠隔肝損傷的保護作用。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，安五脂素也能夠顯著提高D-半乳糖處理的小鼠血清ALT、AST水平[8]，提示安五脂素可能作為肝臟損傷保護劑用于多種原因所致的肝損傷的預防和治療。

ROS及PKC二者密切相關，相互促進其生成及活化[20-22]。本實驗通過檢測大鼠肝ROS及PKC的含量，結果顯示II/R使大鼠肝ROS及PKC的含量顯著（P＜0.05）升高。這一結果與其他文獻報道的腸缺血再灌注伴隨ROS大量生成的結果一致[35-36]。而安五脂素不僅使ROS的含量顯著下降（P＜0.05），同時也使PKC的含量顯著降低（P＜0.05）。因此可以推測，安五脂素在缺血再灌注過程中對ROS及PKC的作用使得兩者在低水平上達到一個新的平衡，從而降低了氧化應激的程度，減少了組織器官的損傷。

為進一步驗證安五脂素在腸缺血再灌注大鼠肝組織中發(fā)揮的抗氧化作用，本實驗又測定了SOD、CAT、GST、MDA及8-OHdG等氧化相關指標，從不同方面反映安五脂素對氧化應激的影響。實驗結果顯示，安五脂素能夠升高II/R大鼠肝SOD、CAT、GST三種抗氧化酶活性，降低氧化損傷產(chǎn)物MDA及8-OHdG的含量，進一步驗證了安五脂素的抗氧化作用。這與安五脂素對D-半乳糖處理的小鼠肝臟、腦和肌肉組織及慢性疲勞小鼠肌肉組織中的SOD活性和MDA水平的影響是一致的，顯示了其在體內(nèi)廣泛的抗氧化功效[8,37-39]。提示安五脂素可能通過增強機體組織抗氧化酶活性，進而緩解各種原因所致的機體氧化損傷。

綜上，安五脂素對大鼠腸缺血再灌注致遠隔肝損傷具有顯著的保護作用，該作用可能與其發(fā)揮抗氧化活性有關。本研究為開發(fā)安五脂素及南五味子保健食品及藥品，用于改善不同原因導致的肝功能損傷提供了實驗基礎。