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        星蔞承氣湯對(duì)急性腦缺血模型大鼠行為學(xué)及CREB-BDNF通路的影響

        2021-06-17 12:57:20悅,于博,許潔,佟陽(yáng)
        陜西中醫(yī) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:承氣湯腦組織缺血性

        劉 悅,于 博,許 潔,佟 陽(yáng)

        (遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腦病科,遼寧 沈陽(yáng) 110034)

        腦血管疾病發(fā)病率近年來(lái)有逐年上升的趨勢(shì),其中約有75%的腦血管事件屬于缺血性腦卒中,大多數(shù)患者遺留明顯肢體、語(yǔ)言以及認(rèn)知方面的障礙,嚴(yán)重影響患者重返社會(huì)[1-3]。雖然現(xiàn)代康復(fù)訓(xùn)練可在一定程度上改善患者的功能障礙,但效果仍差強(qiáng)人意。中醫(yī)在腦血管疾病中的作用有目共睹,缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”“偏枯”等范疇,毒邪是風(fēng)、火、痰、瘀各種因素量變到質(zhì)變的結(jié)果,隨著研究深入“毒損腦絡(luò)”病機(jī)理論被逐漸認(rèn)可,大承氣湯是《傷寒論》中化痰通腑的經(jīng)典方,該方被大量用于治療缺血性腦卒中[4],但其作用機(jī)制目前尚無(wú)統(tǒng)一定論,本團(tuán)隊(duì)利用中腦動(dòng)脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠模擬人體急性腦卒中病理,探討星蔞承氣湯的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本研究選用上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)健康成年體重為200~250 g的SPF雌性大鼠45只,喂養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房。動(dòng)物房處于恒溫恒濕環(huán)境,恒定溫度為22 ℃,濕度為50%,光照黑暗各12 h交替,動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)原則。

        1.1.2 儀器及試劑:PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀DNA測(cè)序列分析儀、BIO RAD凝膠成像儀、韓式穴位神經(jīng)刺激儀、RM2235切片機(jī)、VE-180垂直電泳槽、PMSF、電泳膠配液、BCA蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光液,β-actin、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Camp-response element binding protein,CREB)抗體、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)抗體。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 模型的建立:模型組及中藥組大鼠參照改良的Longa等[5]線栓法進(jìn)行MCAO模型的制備,具體過(guò)程如下:先將大鼠進(jìn)行稱重,根據(jù)每只大鼠的不同體重注射一定比例(0.3 ml/kg)10%的水合氯醛,待大鼠充分麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)面上,充分清理大鼠頸部皮膚后做一豎型切口,隨后用完鉗緩慢剝離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,用尼龍繩于頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈近心端結(jié)扎,并用動(dòng)物血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,隨后于頸總動(dòng)脈處做一切口,將線栓緩慢插入切口并推送至頸內(nèi)動(dòng)脈,直至出現(xiàn)抵觸感后停止推送。將線栓固定于頸總動(dòng)脈后縫合傷口,常規(guī)消毒??瞻捉M大鼠僅接受麻醉、剝離血管后縫合皮膚及常規(guī)消毒。

        1.2.2 分組與給藥:45只SPF大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及中藥組,每組各15只??瞻捉M及模型組大鼠不進(jìn)行任何干預(yù)手段,中藥組大鼠在造模第2天開(kāi)始接受星蔞承氣湯灌胃治療。方劑:全瓜蔞、膽南星各12 g,生大黃9 g,芒硝6 g,水煎,劑量按照按人/鼠公斤體重的等效劑量計(jì)算,1次/d,連續(xù)干預(yù)7 d。模型組及空白組予等體積生理鹽水灌胃。

        1.2.3 行為學(xué)變化:采用改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分(Modified Neurological Severity Scores,mNSS)對(duì)各組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評(píng)估,該量表主要從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射、平衡4個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行測(cè)評(píng);總分18分,分?jǐn)?shù)越高提示神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。

        1.2.4 腦梗死體積:每組隨機(jī)抓取3只大鼠,麻醉后脫頸處死,快速取腦后將腦組織置于-80 °C冰箱冰凍20 min,隨后取出腦組織冠狀面平均切成5等份,采用2,3,5-氯化三苯四唑液體對(duì)腦組織進(jìn)行均勻染色,腦梗死體積區(qū)域顯示蒼白色,未梗死區(qū)域顯示紅色。隨后將染色后的腦組織取出后排列于器皿內(nèi),用高清數(shù)碼相機(jī)拍攝后輸入計(jì)算機(jī),采用相關(guān)圖像處理系統(tǒng)計(jì)算腦梗死體積。

        1.2.5 CREB-BDNF通路標(biāo)志性蛋白水平的測(cè)定:采用免疫組化法對(duì)BDNF的蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,每組隨機(jī)抓取3只大鼠,用事先配制好的多聚甲醛從大鼠的心耳處進(jìn)行灌流,隨后取出腦梗死組織,進(jìn)行組織修剪切塊,隨后將修切的腦組織進(jìn)行梯度脫水,將充分脫水的腦組織浸蠟包埋,隨后進(jìn)行切片、撈片、烘片,將組織薄片置于防脫載玻片上,進(jìn)行抗原修復(fù)、染色,將按一定比例稀釋后的一滴滴加到切片上隨后用PBS溶液漂洗,再加入羊抗鼠/兔IgG聚合物試劑,孵育10 min后再次用PBS溶液漂洗,將DAB顯色液滴入,并在顯微鏡下觀察顯色,再用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片處理,隨后光鏡下進(jìn)行讀片,對(duì)陽(yáng)性目標(biāo)光密度進(jìn)行測(cè)量。

        1.2.6 CREB-BDNF mRNA水平的測(cè)定:在腦組織樣品加入Buffer TBP(與腦組織按照1∶2比例加入)后混勻后靜置1 min,將樣本充分離心后摒棄上清液,再次加入等量Buffer TBP后置于4 ℃,2000 r/min下離心10 min取白色沉淀物。將事先混合好的Buffer digestion與Proteinase 濃液再次加入至檢測(cè)樣本內(nèi),充分震蕩后進(jìn)行水浴(56 ℃恒溫)5 min,加入Buffer PR后混勻,-20 ℃下靜置15 min后室溫、3000 r/min條件下離心10 min,吸取上清液,將異丙醇濃液加入上清液內(nèi)充分混勻,室溫下靜置5 min,室溫、3000 r/min條件下離心10 min,摒棄上清液后加入75%乙醇,充分混勻,室溫下靜置5 min,室溫、3000 r/min條件下離心10 min,再次摒棄上清液。室溫下待乙醇充分揮發(fā)后加入TE Buffer提取DNA。嚴(yán)格按照聚合酶鏈反應(yīng)條件,即變性溫度、變性時(shí)間、退火溫度、退火時(shí)間、延伸溫度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。GAPDH引物上游序列5’-CAACGGGAAAC-CCATCACCA-3’;下游序列5’-ACGCCAGTAGACTC-CACGACAT-3’。CREB引物上游序列5’-CAACCGGCAC-CCATCGAAC-3’;下游序列5’-ACGCCATCGAGCACTC-CACATCCT-3’。BDNF引物上游序列5’-CAACCCGAAAC-CCATCAGAA-3’;下游序列5’-ACGCCAGTCAGCACTC-CACGAGCT-3’。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行研究數(shù)據(jù)的分析。所得計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)描述,組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)或兩樣本秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 三組大鼠行為能力評(píng)分比較 造模后,模型組及中藥組大鼠活動(dòng)能力明顯減弱;中藥組在治療后mNSS評(píng)分降低,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

        表1 三組大鼠mNSS評(píng)分比較(分)

        2.2 三組大鼠腦梗死體積比較 造模后模型組及中藥組大鼠出現(xiàn)明顯腦梗死區(qū)域,中藥組在治療后腦梗死區(qū)域縮小,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1、2。

        圖1 三組大鼠腦片TTC染色結(jié)果

        圖2 兩組大鼠腦梗死體積比較

        2.3 三組大鼠腦組織CREB、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)比較 模型組及中藥組大鼠腦組織CREB、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下調(diào)。中藥組在治療后CREB、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)有所提升,明顯高于模型組,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2(圖3)。

        表2 三組大鼠腦組織CREB、BDNF/內(nèi)參IOD比較

        圖3 三組大鼠腦組織CREB、BDNF蛋白表達(dá)

        2.4 三組大鼠腦組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)比較 造模后模型組及中藥組大鼠腦組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。中藥組在治療后CREB、BDNF mRNA有所提升,且高于模型組(P<0.05),見(jiàn)表3(圖4)。

        表3 三組大鼠治療后CREB、BDNF mRNA/內(nèi)參比較

        圖4 三組大鼠腦組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)

        3 討 論

        缺血性腦卒中是臨床腦血管疾病的主要發(fā)病類型,其中大腦中動(dòng)脈的梗死最為多見(jiàn)。由于大鼠的腦血管解剖結(jié)構(gòu)及生理病理機(jī)制與人類極為相近,且對(duì)手術(shù)的耐受較為理想,故本研究選用SD大鼠制備大腦中動(dòng)脈缺血?jiǎng)游锬P鸵阅M人類缺血性腦卒中。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”“偏枯”等范疇,是由多種因素共同作用的復(fù)雜病理過(guò)程,其中風(fēng)、火、痰、瘀是主要因素,毒邪是風(fēng)、火、痰、瘀各種因素量變到質(zhì)變的結(jié)果,故現(xiàn)代醫(yī)家[6-10]提出了“毒損腦絡(luò)”的病機(jī)理論。認(rèn)為急性中風(fēng)患者體內(nèi)存在諸多內(nèi)毒,包括熱毒、瘀毒、戾毒,諸多內(nèi)毒相互作用破壞腦絡(luò),損害腦髓,導(dǎo)致腦組織氣血滲、透灌流異常,神機(jī)失用,經(jīng)絡(luò)不養(yǎng),故導(dǎo)致半身偏枯失用。臨床長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn),痰熱腑實(shí)證是中風(fēng)初始階段的重要證型,多數(shù)患者存在大便秘結(jié)、舌苔黃膩、脈弦滑等征象,此類征象不但是熱證、痰證、腑實(shí)證的共同臨床表現(xiàn),亦是中風(fēng)疾病在此階段的核心病機(jī),風(fēng)痰瘀火之毒遏制脈絡(luò),氣機(jī)升降失司,腑氣不通,神明受擾,形體敗壞。因此化痰通腑,祛邪解毒是缺血性腦卒中急性期的治療關(guān)鍵點(diǎn)[11-12]。

        大承氣湯是《傷寒論》中化痰通腑的經(jīng)典方,星蔞承氣湯是由大承氣湯化裁而來(lái),由王永炎教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)。本方由全瓜蔞、膽南星、生大黃、芒硝組合而成,方中瓜蔞性寒味苦,有清熱化痰、寬胸散結(jié)之功效,同時(shí)伴有潤(rùn)燥滑腸的作用;膽南星性涼味苦,是清熱化痰,熄風(fēng)止痙之良品;大黃苦寒,有瀉熱毒,破積滯,行瘀血的功效。芒硝咸、苦,寒,有瀉熱通便,潤(rùn)燥軟堅(jiān),清火消腫的作用。諸藥合用,降胃氣,以恢復(fù)其主降的功能;清化熱痰濁毒,防止痰熱化風(fēng),風(fēng)痰上擾,竅閉神昏諸證。其瀉下作用雖然猛烈,但由于方證相應(yīng),善其應(yīng)用,標(biāo)本相得,邪氣乃伏[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)加用星蔞承氣湯后大鼠的mNSS評(píng)分明顯下降,說(shuō)明星蔞承氣湯可明顯改善急性腦卒中大鼠的神經(jīng)缺損癥狀,此外我們利用TTC染色證實(shí)模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯梗死灶,提示此研究造模成功,并發(fā)現(xiàn)星蔞承氣湯可明顯縮小大鼠的腦梗死體積,說(shuō)明該方有明顯的腦保護(hù)效應(yīng)。

        在探討星蔞承氣湯作用機(jī)制時(shí)我們對(duì)各組大鼠腦組織的CREB-BDNF信號(hào)通路標(biāo)志性蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比。CREB-BDNF信號(hào)通路是維持中樞神經(jīng)正常生理活動(dòng)重要的途徑,與神經(jīng)的再生、分化、存活等過(guò)程關(guān)系密切。有研究顯示急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的CREB表達(dá)受抑制,CREB在神經(jīng)元缺血缺氧后的神經(jīng)再生作用毋庸置疑,BDNF是CREB下游的關(guān)鍵因子,于80年代初由德國(guó)神經(jīng)生物學(xué)家Brade首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,研究人員證實(shí)BDNF屬于與神經(jīng)生長(zhǎng)、增殖、凋亡密切相關(guān)的、廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種蛋白質(zhì),是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族重要成員之一[16-17],被認(rèn)為是治療不同神經(jīng)性疾病的潛在藥物。在神經(jīng)生長(zhǎng)、成熟階段,BDNF充分參與調(diào)節(jié)合成代謝、增加神經(jīng)元胞體大小、促進(jìn)受損神經(jīng)元修復(fù)并促進(jìn)其再生。此外,BDNF濃度上調(diào)還可刺激成熟神經(jīng)元軸突、樹(shù)突的萌芽,并增強(qiáng)放大突觸間的信號(hào)傳遞,增強(qiáng)突出前后長(zhǎng)時(shí)程,介導(dǎo)神經(jīng)元的可塑性[18]。BDNF廣泛分布于大腦皮層、海馬、丘腦、小腦等,其中皮層及海馬的含量最為豐富。本研究中我們利用Western blot法及PCR法發(fā)現(xiàn)急性腦卒中大鼠腦組織BDNF蛋白及mRNA的水平明顯下降,經(jīng)過(guò)星蔞承氣湯干預(yù)后大鼠腦組織BDNF蛋白及mRNA的水平均明顯上調(diào),說(shuō)明星蔞承氣湯通過(guò)上調(diào)BDNF的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)效應(yīng)。

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