盧玉潤，唐宇帆

(1.四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院,四川 成都 610072;2.四川大學華西公共衛(wèi)生學院 四川大學華西第四醫(yī)院,四川 成都 610041)

目前，缺血性心臟病嚴重危害人類身體健康，其發(fā)病率日趨上升。氧氣是心肌細胞維持正常功能所必需的物質(zhì)。心臟依靠血液供應氧氣，所以缺血引起缺氧時可造成心肌損傷、心臟功能下降等[1-2]。中藥肉桂是樟科植物的干燥樹皮，有補火益陽，祛寒止痛，溫經(jīng)通血之功效，能暖脾胃，除積冷，通血脈，可治宮寒、腹痛、腰痛、胸痹等[3-4]。研究表明，肉桂醛可以改善高糖毒性對乳鼠心肌細胞的損傷，抑制心肌成纖維細胞凋亡[5]。肉桂通過改善心肌能量代謝減輕糖尿病大鼠心肌損傷[6]。低氧誘導因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)在低氧信號轉(zhuǎn)導中起著重要的介導作用。血管內(nèi)皮因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種促血管生長的因子。HIF-1α可通過與VEGF啟動子區(qū)缺氧反應元件(Hypoxia response element，HRE)結(jié)合激活VEGF基因的表達[7-8]。

本研究通過建立心肌細胞缺氧模型，分析不同劑量肉桂作用下，心肌細胞的增殖與凋亡情況；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物(Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)含量的變化；心肌損傷標志蛋白肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)、肌酸激脢同工酶(Creatine kinase MB，CK-MB)、肌紅蛋白(Myoglobin,Myo)、HIF-1α、VEGF表達量的變化，探究肉桂對心肌細胞缺氧損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞：心肌細胞H9c2購自ATCC公司。

1.1.2 主要試劑與儀器：DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司；青霉素、鏈霉素、總蛋白提取試劑盒和PBS購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶購自吉諾生物制藥技術有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司；SOD試劑盒、MDA測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TBARS檢測試劑盒購自Abnova公司；山羊抗鼠cTnT、CK-MB、Myo、β-actin單抗以及HRP-Tag兔抗山羊購自Cell Signaling公司；兔抗大鼠VEGF、HIF-1α單抗和辣根過氧化物酶山羊抗兔購自上?？党缮锛夹g有限公司。儀器包括BIO-RAD酶標儀(山東博科科學儀器有限公司，型號IMARK)、奧斯巴林熒光顯微鏡(南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號BX53)。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉桂：購自安國市弘發(fā)中藥飲片有限公司，批號160501。稱取肉桂0.5 g，加入5 ml的ddH2O，得100 mg/ml肉桂水煎液。

1.2.2 建模、分組及給藥：心肌細胞H9c2用含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，選對數(shù)生長期細胞進行實驗。根據(jù)參考文獻[9]配制缺氧液：pH 6.8、37 ℃。用缺氧液替換DMEM培養(yǎng)液以模擬人體內(nèi)缺氧環(huán)境，在高濃度飽和N2(>95%，1 L/min)下作用30 min，在密閉缺氧培養(yǎng)箱(94%的N2，5%的CO2，O2≤1%)中孵育6 h，構(gòu)建慢性缺氧模型。

細胞隨機分成五組?？瞻讓φ战M：用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，不加肉桂水煎液處理；缺氧組：參照上述方法，構(gòu)建缺氧模型，不加肉桂水煎液處理；肉桂低劑量組：取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，加入終濃度為0.2 mg/ml的肉桂水煎液預處理細胞，然后做缺氧處理；肉桂中劑量組：取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，加入終濃度為1 mg/ml的肉桂水煎液預處理細胞，然后做缺氧處理；肉桂高劑量組：取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，加入終濃度為5 mg/ml的肉桂水煎液預處理細胞，然后做缺氧處理。各組細胞均在37 ℃孵育。

1.2.3 CCK-8法檢測各組細胞增殖情況：分別收集培養(yǎng)0、24、48、72 h的各組細胞，按試劑盒操作進行，酶標儀檢測各孔450 nm處的OD值。

1.2.4 一步法TUNEL試劑盒檢測各組細胞凋亡情況：取對數(shù)生長期心肌細胞H9c2，接種于24孔板中的載玻片上(濃度為2×105個/L)，每孔500 μl，培養(yǎng)24 h后，按1.2.2 方法進行藥劑和缺氧處理。細胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒方法進行操作，在熒光顯微鏡(×100倍)下觀察。隨機選5個視野，計數(shù)發(fā)綠色熒光細胞數(shù)，取平均值表示凋亡細胞數(shù)。細胞凋亡指數(shù)以凋亡細胞數(shù)與視野下細胞總數(shù)的比值表示。實驗重復3次取均值。

1.2.5 SOD活性與MDA、TBARS含量測定：37 ℃孵育48 h后，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，按SOD、MDA和TBARS試劑盒說明書操作，分別于酶標儀532、550、535 nm處測定吸光度。

1.2.6 Western blot檢測cTnT、CK-MB、Myo、HIF-1α、VEGF蛋白表達：37 ℃孵育48 h后，提取細胞總蛋白，并用二喹啉甲酸法進行定量。100 ℃加熱5 min至蛋白變性后，每組取蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜。封閉PVDF膜后，用1∶500倍稀釋的cTnT、CK-MB、Myo、β-actin、HIF-1α和VEGF抗體于4 ℃分別孵育膜24 h。洗滌后加入1∶5000倍稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h。加入ECL化學發(fā)光劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞增殖和凋亡情況比較 與空白對照組比較，缺氧組的增殖活力降低、凋亡指數(shù)明顯升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與缺氧組比較，各劑量肉桂組的增殖活力以劑量依賴性的方式逐漸升高，而凋亡指數(shù)則逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖和凋亡情況比較

2.2 各組細胞氧化應激相關指標比較 與空白對照組比較，缺氧組細胞上清液SOD活性較低，MDA、TBARS含量較高，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與缺氧組比較，各劑量肉桂組細胞上清液SOD活性以劑量依賴性逐級增加，而MDA和TBARS含量則逐漸降低，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞氧化應激相關指標比較

2.3 各組細胞心肌損傷標志蛋白比較 Western blot檢測cTnT、CK-MB和Myo蛋白表達，缺氧組中各蛋白表達較空白對照組高，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。各劑量肉桂組與缺氧組比較，三種標志蛋白表達量均以劑量依賴性逐級降低，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表3(圖1)。

表3 各組細胞心肌損傷標志蛋白表達比較

圖1 各組細胞cTnT、CK-MB和Myo蛋白表達

2.4 各組細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達比較 Western blot檢測各組HIF-1α和VEGF蛋白表達，缺氧組中這兩種蛋白表達比空白對照組高(均P<0.05)；各劑量肉桂組與缺氧組比較，HIF-1α、VEGF蛋白表達以劑量依賴性逐級增高(均P<0.05)。見表4(圖2)。

表4 各組細胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達比較

圖2 各組細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達

3 討 論

肉桂是一種具有強抗氧化活性的植物，在中醫(yī)學中常用于改善心臟功能。研究顯示在局部心肌缺血大鼠模型中，肉桂皮提取物對缺血性心律不齊和心臟損傷具有保護作用[10-12]。SOD、MDA、TBARS等氧化指標常用來反映機體氧化應激水平[13-14]。SOD是一種生命體內(nèi)源抗氧化酶，可清除自由基[15-16]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可加劇細胞膜的損傷[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)肉桂處理后能明顯提高心肌細胞SOD活性，降低MDA、TBARS含量。表明肉桂對缺氧誘導的氧化應激有較好的保護作用，其機制可能與清除自由基和減少脂質(zhì)代謝產(chǎn)物密切相關。缺氧處理促使心肌損傷標志蛋白cTnT、CK-MB和Myo的表達量顯著升高，而肉桂處理可以劑量依賴性的方式抑制這三種標志蛋白表達量的升高[20-21]。說明肉桂對缺氧誘導的心肌細胞損傷有保護作用。

HIF-1α在缺血性心肌病與心力衰竭中通過參與血管張力調(diào)節(jié)、血管生長因子、葡萄糖攝取以及糖酵解等途徑調(diào)控氧的傳遞，增強缺氧組織的存活能力，發(fā)揮心肌保護作用[22-24]。本研究結(jié)果顯示心肌缺氧細胞HIF-1α蛋白水平明顯提高，分析為缺氧處理初期心肌細胞的適應性反應。研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷通過自噬的HIF-1α/BNIP3途徑減輕心肌缺血再灌注損傷[25-26]。七氟醚通過Akt /HIF-1α/VEGF信號通路減輕心臟的氧化應激，改善缺血再灌注引起的心肌損傷[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，肉桂可上調(diào)缺氧心肌細胞中VEGF蛋白表達水平。據(jù)此推斷肉桂可能通過促進HIF-1α及VEGF高表達來保護血管內(nèi)皮細胞、促進血管新生，從而保護缺氧介導的心肌細胞損傷。

綜上所述，肉桂對慢性缺氧心肌細胞具有保護作用，其機制可能與激活HIF-1介導的低氧反應通路有關，初步揭示了肉桂的心臟保護作用機制，為肉桂治療缺血性心臟病提供實驗依據(jù)。