陳燕偉,馬善波,權 偉,張 蕊
(1.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院,陜西 西安 710032;2.西安市精神衛(wèi)生中心,陜西 西安 710199)
焦慮癥的臨床癥狀為持續(xù)性精神應激或陣發(fā)性驚恐,常伴有自主神經功能障礙[1]。焦慮癥是一種慢性精神疾病,患病率高,給社會帶來了沉重的負擔[2]。目前西醫(yī)治療該病以口服抗焦慮藥物為主,臨床效果不理想,且極易產生藥物性依賴,因此越來越多的患者趨向于中醫(yī)治療[3]。中醫(yī)將焦慮癥歸于“郁病”范疇,且臨床表現與“驚病”“臟燥”“恐病”等相似,其發(fā)病與心、脾、肝、腎等臟腑功能失調紊亂有關[4]。柴胡味苦、辛,微寒,歸肝、膽、肺經,是傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根。據《神農本草經》記載,柴胡具有解表退熱、升舉陽氣、疏肝解郁的功效。柴胡皂苷D是從中藥柴胡中分離提取的有效單體成分之一,具有抗炎、免疫調節(jié)、抗病毒和抗癌活性[5-6]。但柴胡皂苷D治療焦慮癥臨床鮮有報道,本文重點研究柴胡皂苷D對于慢性應激誘導焦慮模型小鼠的影響及其作用機制。
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物:50只4周齡雄性ICR小鼠,體重18~22 g,購于空軍軍醫(yī)大學動物中心,常規(guī)條件下飼養(yǎng)于SPF動物中心。
1.1.2 實驗藥物與試劑:柴胡皂苷D由國家食品藥品檢定研究院提供(批號110778-201912)。鹽酸氟西汀購自常州思耀制藥有限公司(批號WJ-100774)。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒均購自南京科創(chuàng)生物科技股份有限公司。丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽轉移酶均購自南京建成生物有限公司。受體相互作用蛋白140(Receptor-interacting protein 140,RIP140)、磷酸化-核轉錄因子κB-p65(Phosphonated nuclear transcription factor κB-p65,p-NF-κB-p65)、核轉錄因子κB-p65(Nuclear transcription factor κB-p65,NF-κB-p65)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(Phosphonated inhibitor of NF-κB α,p-IκBα)、NF-κB抑制蛋白α(Inhibitor of NF-κB α,IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶(Phosphonated inhibitor of kappa B kinase α,P-IKKa)、真核NF-κB抑制蛋白激酶(Inhibitor of kappa B kinase α,IKKα)、IκB激酶β(Inhibitor of kappa B kinase β,IKK-β)、磷酸化IκB激酶β(Phosphonated inhibitor kappa B kinase β,p-IKK-β)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。
1.1.3 實驗儀器:離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號Heraeus Fresco 17 Centrifuge)、電泳儀(北京市六一儀器廠,型號DYY-6C)、雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司,型號Odyssey CLK)、多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司,型號Spectra Max i3x)、分析天平(瑞士Mettler Toledo公司,型號ME104E)、酶標儀[成都貝斯達儀器有限公司,型號(雷杜RT-6000)]、正置顯微鏡(日本尼康公司,型號Eclipse Ti2)。
1.2 實驗方法
1.2.1 造模、分組及給藥:采用隨機數字表法將50只小鼠隨機分為正常組10只、慢性應激組10只、氟西汀組(20 mg/kg)10只、柴胡皂苷D低劑量組(20 mg/kg)10只、和柴胡皂苷D高劑量組(40 mg/kg)10只。除正常組外,其余四組小鼠均連續(xù)6周暴露于慢性應激環(huán)境建立焦慮模型。慢性應激程序按經典模型文獻[7]進行。在1周的適應期后,予小鼠以下應激源:禁食禁水24 h、過夜光照、籠子傾斜45°、潮濕的鋸屑環(huán)境、暴露于外來物體、光暗循環(huán)的倒置、懸伸10 min、暴露于空瓶、尾部收縮1 min。所有程序都是隨機組織的,以確保實驗的不可預測性,應激源的頻率參照既往文獻標準[8]。從第4周開始,氟西汀組小鼠每天灌胃1次氟西汀,劑量為20 mg/kg;柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組分別給予20、40 mg/kg的柴胡皂苷D灌胃;其余兩組小鼠予等量生理鹽水,均連續(xù)灌胃3周。
1.2.2 蔗糖偏好測試:各組小鼠末次灌藥后,禁食禁水24 h,每籠同時放置2個水瓶,2個水瓶與籠內小鼠的距離相等,一瓶裝有1%蔗糖水,另一瓶裝有蒸餾水,6 h后兩個水瓶互換位置,分別在實驗前及12 h后稱重水瓶以評估最終消耗量。蔗糖偏好=蔗糖攝入量/(蔗糖攝入量+水攝入量)×100%。
1.2.3 曠場實驗:將40 cm×60 cm×50 cm大小的觀察籠分成12個相等的正方形。各組小鼠末次灌藥后,將小鼠放在儀器的中央,同時進行攝像和計時,記錄修飾次數和穿越格子次數,觀察4 min后停止攝像,修飾次數指的是單位時間內小鼠的前肢向上抬舉、抓癢、洗臉、舔足等動作的次數[9]。
1.2.4 強迫游泳試驗:在文獻[10]所述的常規(guī)方法基礎上進行強迫游泳測試。各組小鼠末次灌藥后,將小鼠單獨放入高20 cm、直徑14 cm開放的圓柱形透明容器,溫度控制在(25±1)℃,容器內水位高12 cm,并強迫小鼠游泳6 min。在最后4 min內,由兩名對實驗不了解的獨立觀察者記錄小鼠不動時間為強迫游泳不動時間。小鼠在水中漂浮而沒有掙扎和逃跑行為的時間被定義為不動時間。
1.2.5 尾部懸掛試驗:在文獻[11]描述的常規(guī)方法基礎上進行尾部懸掛實驗。各組小鼠末次灌藥后,將聽覺和視覺分離的小鼠用膠帶在距離尾部末端2 cm處固定,將其懸掛6 min,頭部離地面約50 cm。由兩名對實驗不了解的獨立觀察者測量最后4 min內的不動時間。
1.2.6 ELISA法檢測炎癥細胞因子水平:各組小鼠行為學測試后,眼球采血后頸椎脫臼法處死,將血樣放入離心管內,3500 r/min,離心10 min,收集血清。將標準品稀釋后加樣,置37 ℃孵育30 min,20 ml的30×PBS緩沖液、580 ml純水配制成600 ml、pH值為7.4的洗液,孵育完成后撤掉封板膜,棄液后甩干,加洗滌液靜置30 s后棄去,重復5次,加酶50 μl,再次溫育、洗滌,加顯色劑A、B顯色,37 ℃避光顯色15 min后加終止液50 μl,用微孔板分光光度計在450 nm讀取每個孔的吸光度。計算血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平。
1.2.7 Western blot法檢測RIP140/NF-κB相關蛋白表達:取100 mg海馬組織,用溶解緩沖液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA)冰上提取30 min,4 ℃,12000 r/min,離心5 min以去除碎片。將樣品加至SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上,并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜,用5%脫脂乳封閉,然后用TBST洗滌3次后,室溫下用二抗體孵育1 h,用ECL高級試劑盒建立并固定條帶。采用圖像分析軟件進行數據分析。
1.2.8 免疫組織化學法檢測RIP140蛋白表達:用含有4%多聚甲醛溶液固定海馬組織,石蠟包埋,切片,將海馬石蠟切片4 ℃下加熱1 h,二甲苯脫蠟,分級乙醇水合,用緩沖液洗滌載玻片,1% H2O2處理15 min,牛血清白蛋白封閉切片,予抗RIP140和p-NF-κB-p65的一級抗體4 ℃孵育過夜,緩沖液洗滌樣品后,予生物素化的二級抗體和抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復合物孵育,蘇木精復染載玻片。采用圖像分析軟件進行數據分析。
2.1 各組小鼠蔗糖偏好比較 慢性應激組小鼠蔗糖偏好明顯低于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠蔗糖偏好均高于慢性應激組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
表1 各組小鼠蔗糖偏好比較(%)
2.2 各組小鼠穿越次數、修飾次數比較 慢性應激組小鼠穿越次數、修飾次數明顯低于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠穿越次數、修飾次數高于慢性應激組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。
表2 各組小鼠穿越次數和修飾次數比較(次)
2.3 各組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間比較 慢性應激組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間長于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間均短于慢性應激組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。
表3 各組小鼠懸尾不動時間與強迫游泳不動時間比較(min)
2.4 各組小鼠炎癥細胞因子水平比較 慢性應激組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表達高于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β均低于慢性應激組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表4。
表4 各組小鼠炎癥細胞因子水平比較(pg/mg)
2.5 各組小鼠RIP140/NF-κB相關蛋白相對表達比較 由圖1可知,與正常組小鼠比較,慢性應激組小鼠海馬組織中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表達上調,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與慢性應激組小鼠比較,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠海馬組織RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表達下調,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。
A:正常組;B:慢性應激組;C:氟西汀組;D:柴胡皂苷D低劑量組;E:柴胡皂苷D高劑量組
2.6 各組小鼠RIP140蛋白表達比較 與正常組小鼠比較,慢性應激組小鼠海馬組織中RIP140蛋白表達上調;與慢性應激組小鼠比較,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組小鼠海馬組織中RIP140蛋白表達下調(圖2)。
A:正常組;B:慢性應激組;C:氟西汀組;D:柴胡皂苷D低劑量組;E:柴胡皂苷D高劑量組
中醫(yī)將焦慮癥歸屬于“郁病”范疇,并與“驚悸”“奔豚”“怔忡”等存在一定聯(lián)系[12]。焦慮癥屬于中醫(yī)情志疾病,與肝、心、腎、膽、脾等臟腑關系密切,以肝失疏泄、肝郁氣滯、心脾失養(yǎng)、陰陽氣血失調為主要病機。柴胡具有疏肝理氣、解郁活血的功效,臨床常用于肝郁氣滯證,代表方劑為柴胡疏肝散[13]。分析中藥復方治療焦慮癥的用藥規(guī)律,中藥柴胡出現頻次位列第四[14]。研究表明柴胡加龍骨牡蠣湯可改善廣泛性焦慮癥患者癥狀[15],并發(fā)現其作用機制與柴胡加龍骨牡蠣湯可以改善曠野實驗、迷宮實驗評分,抑制核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號介導的炎癥反應,減少炎癥因子釋放有關[16]。
現代醫(yī)學研究表明,神經炎癥在焦慮癥中起著重要作用[17]。TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎細胞因子在情緒行為和神經內分泌的調節(jié)中起重要作用,且有研究證實,IL-1β參與神經內分泌系統(tǒng)的調節(jié),因此檢測小鼠海馬組織促炎細胞因子濃度。本實驗結果表明,慢性應激組小鼠體內TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平均有不同程度的升高,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組、氟西汀組均降低了慢性應激誘導焦慮模型小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平。
RIP140蛋白是介導炎癥級聯(lián)反應的主要因素。RIP140蛋白可激活促炎細胞因子生成,調節(jié)巨噬細胞炎癥進程,進一步與NF-κB或環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白相互作用。此外,NF-κB抑制蛋白的磷酸化觸發(fā)NF-κB的激活,促進促炎基因的轉錄和炎癥細胞因子表達[18]。本研究結果顯示,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組、氟西汀組均降低慢性應激誘導焦慮模型小鼠海馬組織中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白表達水平。