陳燕偉，馬善波，權(quán) 偉，張 蕊

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；2.西安市精神衛(wèi)生中心，陜西 西安 710199)

焦慮癥的臨床癥狀為持續(xù)性精神應(yīng)激或陣發(fā)性驚恐,常伴有自主神經(jīng)功能障礙[1]。焦慮癥是一種慢性精神疾病，患病率高，給社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。目前西醫(yī)治療該病以口服抗焦慮藥物為主，臨床效果不理想，且極易產(chǎn)生藥物性依賴(lài)，因此越來(lái)越多的患者趨向于中醫(yī)治療[3]。中醫(yī)將焦慮癥歸于“郁病”范疇，且臨床表現(xiàn)與“驚病”“臟燥”“恐病”等相似，其發(fā)病與心、脾、肝、腎等臟腑功能失調(diào)紊亂有關(guān)[4]。柴胡味苦、辛，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，是傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，柴胡具有解表退熱、升舉陽(yáng)氣、疏肝解郁的功效。柴胡皂苷D是從中藥柴胡中分離提取的有效單體成分之一，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗癌活性[5-6]。但柴胡皂苷D治療焦慮癥臨床鮮有報(bào)道，本文重點(diǎn)研究柴胡皂苷D對(duì)于慢性應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型小鼠的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：50只4周齡雄性ICR小鼠，體重18～22 g，購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，常規(guī)條件下飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：柴胡皂苷D由國(guó)家食品藥品檢定研究院提供(批號(hào)110778-201912)。鹽酸氟西汀購(gòu)自常州思耀制藥有限公司(批號(hào)WJ-100774)。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京科創(chuàng)生物科技股份有限公司。丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶均購(gòu)自南京建成生物有限公司。受體相互作用蛋白140(Receptor-interacting protein 140,RIP140)、磷酸化-核轉(zhuǎn)錄因子κB-p65(Phosphonated nuclear transcription factor κB-p65，p-NF-κB-p65)、核轉(zhuǎn)錄因子κB-p65(Nuclear transcription factor κB-p65，NF-κB-p65)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(Phosphonated inhibitor of NF-κB α，p-IκBα)、NF-κB抑制蛋白α(Inhibitor of NF-κB α，IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶(Phosphonated inhibitor of kappa B kinase α，P-IKKa)、真核NF-κB抑制蛋白激酶(Inhibitor of kappa B kinase α,IKKα)、IκB激酶β(Inhibitor of kappa B kinase β,IKK-β)、磷酸化IκB激酶β(Phosphonated inhibitor kappa B kinase β,p-IKK-β)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)Heraeus Fresco 17 Centrifuge)、電泳儀(北京市六一儀器廠，型號(hào)DYY-6C)、雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司，型號(hào)Odyssey CLK)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司，型號(hào)Spectra Max i3x)、分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，型號(hào)ME104E)、酶標(biāo)儀[成都貝斯達(dá)儀器有限公司，型號(hào)(雷杜RT-6000)]、正置顯微鏡(日本尼康公司，型號(hào)Eclipse Ti2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模、分組及給藥：采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只小鼠隨機(jī)分為正常組10只、慢性應(yīng)激組10只、氟西汀組(20 mg/kg)10只、柴胡皂苷D低劑量組(20 mg/kg)10只、和柴胡皂苷D高劑量組(40 mg/kg)10只。除正常組外，其余四組小鼠均連續(xù)6周暴露于慢性應(yīng)激環(huán)境建立焦慮模型。慢性應(yīng)激程序按經(jīng)典模型文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。在1周的適應(yīng)期后，予小鼠以下應(yīng)激源：禁食禁水24 h、過(guò)夜光照、籠子傾斜45°、潮濕的鋸屑環(huán)境、暴露于外來(lái)物體、光暗循環(huán)的倒置、懸伸10 min、暴露于空瓶、尾部收縮1 min。所有程序都是隨機(jī)組織的，以確保實(shí)驗(yàn)的不可預(yù)測(cè)性，應(yīng)激源的頻率參照既往文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[8]。從第4周開(kāi)始，氟西汀組小鼠每天灌胃1次氟西汀，劑量為20 mg/kg；柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組分別給予20、40 mg/kg的柴胡皂苷D灌胃；其余兩組小鼠予等量生理鹽水，均連續(xù)灌胃3周。

1.2.2 蔗糖偏好測(cè)試：各組小鼠末次灌藥后，禁食禁水24 h，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，2個(gè)水瓶與籠內(nèi)小鼠的距離相等，一瓶裝有1%蔗糖水，另一瓶裝有蒸餾水，6 h后兩個(gè)水瓶互換位置，分別在實(shí)驗(yàn)前及12 h后稱(chēng)重水瓶以評(píng)估最終消耗量。蔗糖偏好=蔗糖攝入量/(蔗糖攝入量+水?dāng)z入量)×100%。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將40 cm×60 cm×50 cm大小的觀察籠分成12個(gè)相等的正方形。各組小鼠末次灌藥后，將小鼠放在儀器的中央，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，記錄修飾次數(shù)和穿越格子次數(shù)，觀察4 min后停止攝像，修飾次數(shù)指的是單位時(shí)間內(nèi)小鼠的前肢向上抬舉、抓癢、洗臉、舔足等動(dòng)作的次數(shù)[9]。

1.2.4 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)：在文獻(xiàn)[10]所述的常規(guī)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行強(qiáng)迫游泳測(cè)試。各組小鼠末次灌藥后，將小鼠單獨(dú)放入高20 cm、直徑14 cm開(kāi)放的圓柱形透明容器，溫度控制在(25±1)℃，容器內(nèi)水位高12 cm，并強(qiáng)迫小鼠游泳6 min。在最后4 min內(nèi)，由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)不了解的獨(dú)立觀察者記錄小鼠不動(dòng)時(shí)間為強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。小鼠在水中漂浮而沒(méi)有掙扎和逃跑行為的時(shí)間被定義為不動(dòng)時(shí)間。

1.2.5 尾部懸掛試驗(yàn)：在文獻(xiàn)[11]描述的常規(guī)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行尾部懸掛實(shí)驗(yàn)。各組小鼠末次灌藥后，將聽(tīng)覺(jué)和視覺(jué)分離的小鼠用膠帶在距離尾部末端2 cm處固定，將其懸掛6 min，頭部離地面約50 cm。由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)不了解的獨(dú)立觀察者測(cè)量最后4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子水平：各組小鼠行為學(xué)測(cè)試后，眼球采血后頸椎脫臼法處死，將血樣放入離心管內(nèi)，3500 r/min，離心10 min，收集血清。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加樣，置37 ℃孵育30 min，20 ml的30×PBS緩沖液、580 ml純水配制成600 ml、pH值為7.4的洗液，孵育完成后撤掉封板膜，棄液后甩干，加洗滌液靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，加酶50 μl，再次溫育、洗滌，加顯色劑A、B顯色，37 ℃避光顯色15 min后加終止液50 μl，用微孔板分光光度計(jì)在450 nm讀取每個(gè)孔的吸光度。計(jì)算血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)RIP140/NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)：取100 mg海馬組織，用溶解緩沖液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA)冰上提取30 min，4 ℃，12000 r/min，離心5 min以去除碎片。將樣品加至SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜，用5%脫脂乳封閉，然后用TBST洗滌3次后，室溫下用二抗體孵育1 h，用ECL高級(jí)試劑盒建立并固定條帶。采用圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)RIP140蛋白表達(dá)：用含有4%多聚甲醛溶液固定海馬組織，石蠟包埋，切片，將海馬石蠟切片4 ℃下加熱1 h，二甲苯脫蠟，分級(jí)乙醇水合，用緩沖液洗滌載玻片，1% H2O2處理15 min，牛血清白蛋白封閉切片，予抗RIP140和p-NF-κB-p65的一級(jí)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，緩沖液洗滌樣品后，予生物素化的二級(jí)抗體和抗生物素蛋白-生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物孵育，蘇木精復(fù)染載玻片。采用圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠蔗糖偏好比較 慢性應(yīng)激組小鼠蔗糖偏好明顯低于正常組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠蔗糖偏好均高于慢性應(yīng)激組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠蔗糖偏好比較(%)

2.2 各組小鼠穿越次數(shù)、修飾次數(shù)比較 慢性應(yīng)激組小鼠穿越次數(shù)、修飾次數(shù)明顯低于正常組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠穿越次數(shù)、修飾次數(shù)高于慢性應(yīng)激組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠穿越次數(shù)和修飾次數(shù)比較(次)

2.3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較 慢性應(yīng)激組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于正常組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均短于慢性應(yīng)激組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間與強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較(min)

2.4 各組小鼠炎癥細(xì)胞因子水平比較 慢性應(yīng)激組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)高于正常組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β均低于慢性應(yīng)激組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠炎癥細(xì)胞因子水平比較(pg/mg)

2.5 各組小鼠RIP140/NF-κB相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)比較 由圖1可知，與正常組小鼠比較，慢性應(yīng)激組小鼠海馬組織中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與慢性應(yīng)激組小鼠比較，柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠海馬組織RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

A:正常組；B:慢性應(yīng)激組；C:氟西汀組；D:柴胡皂苷D低劑量組；E:柴胡皂苷D高劑量組

2.6 各組小鼠RIP140蛋白表達(dá)比較 與正常組小鼠比較，慢性應(yīng)激組小鼠海馬組織中RIP140蛋白表達(dá)上調(diào)；與慢性應(yīng)激組小鼠比較，柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組小鼠海馬組織中RIP140蛋白表達(dá)下調(diào)(圖2)。

A:正常組；B:慢性應(yīng)激組；C:氟西汀組；D:柴胡皂苷D低劑量組；E:柴胡皂苷D高劑量組

3 討 論

中醫(yī)將焦慮癥歸屬于“郁病”范疇，并與“驚悸”“奔豚”“怔忡”等存在一定聯(lián)系[12]。焦慮癥屬于中醫(yī)情志疾病，與肝、心、腎、膽、脾等臟腑關(guān)系密切，以肝失疏泄、肝郁氣滯、心脾失養(yǎng)、陰陽(yáng)氣血失調(diào)為主要病機(jī)。柴胡具有疏肝理氣、解郁活血的功效，臨床常用于肝郁氣滯證，代表方劑為柴胡疏肝散[13]。分析中藥復(fù)方治療焦慮癥的用藥規(guī)律，中藥柴胡出現(xiàn)頻次位列第四[14]。研究表明柴胡加龍骨牡蠣湯可改善廣泛性焦慮癥患者癥狀[15]，并發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制與柴胡加龍骨牡蠣湯可以改善曠野實(shí)驗(yàn)、迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)分，抑制核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子釋放有關(guān)[16]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，神經(jīng)炎癥在焦慮癥中起著重要作用[17]。TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎細(xì)胞因子在情緒行為和神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)中起重要作用，且有研究證實(shí)，IL-1β參與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，因此檢測(cè)小鼠海馬組織促炎細(xì)胞因子濃度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性應(yīng)激組小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平均有不同程度的升高，柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組、氟西汀組均降低了慢性應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平。

RIP140蛋白是介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要因素。RIP140蛋白可激活促炎細(xì)胞因子生成，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥進(jìn)程，進(jìn)一步與NF-κB或環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白相互作用。此外，NF-κB抑制蛋白的磷酸化觸發(fā)NF-κB的激活，促進(jìn)促炎基因的轉(zhuǎn)錄和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)[18]。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組、氟西汀組均降低慢性應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型小鼠海馬組織中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白表達(dá)水平。