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        柴胡皂苷D對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠焦慮癥的影響

        2021-06-17 12:57:16陳燕偉馬善波
        陜西中醫(yī) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:柴胡皂苷氟西汀焦慮癥

        陳燕偉,馬善波,權(quán) 偉,張 蕊

        (1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院,陜西 西安 710032;2.西安市精神衛(wèi)生中心,陜西 西安 710199)

        焦慮癥的臨床癥狀為持續(xù)性精神應(yīng)激或陣發(fā)性驚恐,常伴有自主神經(jīng)功能障礙[1]。焦慮癥是一種慢性精神疾病,患病率高,給社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。目前西醫(yī)治療該病以口服抗焦慮藥物為主,臨床效果不理想,且極易產(chǎn)生藥物性依賴(lài),因此越來(lái)越多的患者趨向于中醫(yī)治療[3]。中醫(yī)將焦慮癥歸于“郁病”范疇,且臨床表現(xiàn)與“驚病”“臟燥”“恐病”等相似,其發(fā)病與心、脾、肝、腎等臟腑功能失調(diào)紊亂有關(guān)[4]。柴胡味苦、辛,微寒,歸肝、膽、肺經(jīng),是傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載,柴胡具有解表退熱、升舉陽(yáng)氣、疏肝解郁的功效。柴胡皂苷D是從中藥柴胡中分離提取的有效單體成分之一,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗癌活性[5-6]。但柴胡皂苷D治療焦慮癥臨床鮮有報(bào)道,本文重點(diǎn)研究柴胡皂苷D對(duì)于慢性應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型小鼠的影響及其作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:50只4周齡雄性ICR小鼠,體重18~22 g,購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心,常規(guī)條件下飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物中心。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:柴胡皂苷D由國(guó)家食品藥品檢定研究院提供(批號(hào)110778-201912)。鹽酸氟西汀購(gòu)自常州思耀制藥有限公司(批號(hào)WJ-100774)。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京科創(chuàng)生物科技股份有限公司。丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶均購(gòu)自南京建成生物有限公司。受體相互作用蛋白140(Receptor-interacting protein 140,RIP140)、磷酸化-核轉(zhuǎn)錄因子κB-p65(Phosphonated nuclear transcription factor κB-p65,p-NF-κB-p65)、核轉(zhuǎn)錄因子κB-p65(Nuclear transcription factor κB-p65,NF-κB-p65)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(Phosphonated inhibitor of NF-κB α,p-IκBα)、NF-κB抑制蛋白α(Inhibitor of NF-κB α,IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶(Phosphonated inhibitor of kappa B kinase α,P-IKKa)、真核NF-κB抑制蛋白激酶(Inhibitor of kappa B kinase α,IKKα)、IκB激酶β(Inhibitor of kappa B kinase β,IKK-β)、磷酸化IκB激酶β(Phosphonated inhibitor kappa B kinase β,p-IKK-β)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

        1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào)Heraeus Fresco 17 Centrifuge)、電泳儀(北京市六一儀器廠,型號(hào)DYY-6C)、雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司,型號(hào)Odyssey CLK)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司,型號(hào)Spectra Max i3x)、分析天平(瑞士Mettler Toledo公司,型號(hào)ME104E)、酶標(biāo)儀[成都貝斯達(dá)儀器有限公司,型號(hào)(雷杜RT-6000)]、正置顯微鏡(日本尼康公司,型號(hào)Eclipse Ti2)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 造模、分組及給藥:采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只小鼠隨機(jī)分為正常組10只、慢性應(yīng)激組10只、氟西汀組(20 mg/kg)10只、柴胡皂苷D低劑量組(20 mg/kg)10只、和柴胡皂苷D高劑量組(40 mg/kg)10只。除正常組外,其余四組小鼠均連續(xù)6周暴露于慢性應(yīng)激環(huán)境建立焦慮模型。慢性應(yīng)激程序按經(jīng)典模型文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。在1周的適應(yīng)期后,予小鼠以下應(yīng)激源:禁食禁水24 h、過(guò)夜光照、籠子傾斜45°、潮濕的鋸屑環(huán)境、暴露于外來(lái)物體、光暗循環(huán)的倒置、懸伸10 min、暴露于空瓶、尾部收縮1 min。所有程序都是隨機(jī)組織的,以確保實(shí)驗(yàn)的不可預(yù)測(cè)性,應(yīng)激源的頻率參照既往文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[8]。從第4周開(kāi)始,氟西汀組小鼠每天灌胃1次氟西汀,劑量為20 mg/kg;柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組分別給予20、40 mg/kg的柴胡皂苷D灌胃;其余兩組小鼠予等量生理鹽水,均連續(xù)灌胃3周。

        1.2.2 蔗糖偏好測(cè)試:各組小鼠末次灌藥后,禁食禁水24 h,每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶,2個(gè)水瓶與籠內(nèi)小鼠的距離相等,一瓶裝有1%蔗糖水,另一瓶裝有蒸餾水,6 h后兩個(gè)水瓶互換位置,分別在實(shí)驗(yàn)前及12 h后稱(chēng)重水瓶以評(píng)估最終消耗量。蔗糖偏好=蔗糖攝入量/(蔗糖攝入量+水?dāng)z入量)×100%。

        1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):將40 cm×60 cm×50 cm大小的觀察籠分成12個(gè)相等的正方形。各組小鼠末次灌藥后,將小鼠放在儀器的中央,同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí),記錄修飾次數(shù)和穿越格子次數(shù),觀察4 min后停止攝像,修飾次數(shù)指的是單位時(shí)間內(nèi)小鼠的前肢向上抬舉、抓癢、洗臉、舔足等動(dòng)作的次數(shù)[9]。

        1.2.4 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn):在文獻(xiàn)[10]所述的常規(guī)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行強(qiáng)迫游泳測(cè)試。各組小鼠末次灌藥后,將小鼠單獨(dú)放入高20 cm、直徑14 cm開(kāi)放的圓柱形透明容器,溫度控制在(25±1)℃,容器內(nèi)水位高12 cm,并強(qiáng)迫小鼠游泳6 min。在最后4 min內(nèi),由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)不了解的獨(dú)立觀察者記錄小鼠不動(dòng)時(shí)間為強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。小鼠在水中漂浮而沒(méi)有掙扎和逃跑行為的時(shí)間被定義為不動(dòng)時(shí)間。

        1.2.5 尾部懸掛試驗(yàn):在文獻(xiàn)[11]描述的常規(guī)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行尾部懸掛實(shí)驗(yàn)。各組小鼠末次灌藥后,將聽(tīng)覺(jué)和視覺(jué)分離的小鼠用膠帶在距離尾部末端2 cm處固定,將其懸掛6 min,頭部離地面約50 cm。由兩名對(duì)實(shí)驗(yàn)不了解的獨(dú)立觀察者測(cè)量最后4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

        1.2.6 ELISA法檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子水平:各組小鼠行為學(xué)測(cè)試后,眼球采血后頸椎脫臼法處死,將血樣放入離心管內(nèi),3500 r/min,離心10 min,收集血清。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加樣,置37 ℃孵育30 min,20 ml的30×PBS緩沖液、580 ml純水配制成600 ml、pH值為7.4的洗液,孵育完成后撤掉封板膜,棄液后甩干,加洗滌液靜置30 s后棄去,重復(fù)5次,加酶50 μl,再次溫育、洗滌,加顯色劑A、B顯色,37 ℃避光顯色15 min后加終止液50 μl,用微孔板分光光度計(jì)在450 nm讀取每個(gè)孔的吸光度。計(jì)算血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平。

        1.2.7 Western blot法檢測(cè)RIP140/NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá):取100 mg海馬組織,用溶解緩沖液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA)冰上提取30 min,4 ℃,12000 r/min,離心5 min以去除碎片。將樣品加至SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,用5%脫脂乳封閉,然后用TBST洗滌3次后,室溫下用二抗體孵育1 h,用ECL高級(jí)試劑盒建立并固定條帶。采用圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        1.2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)RIP140蛋白表達(dá):用含有4%多聚甲醛溶液固定海馬組織,石蠟包埋,切片,將海馬石蠟切片4 ℃下加熱1 h,二甲苯脫蠟,分級(jí)乙醇水合,用緩沖液洗滌載玻片,1% H2O2處理15 min,牛血清白蛋白封閉切片,予抗RIP140和p-NF-κB-p65的一級(jí)抗體4 ℃孵育過(guò)夜,緩沖液洗滌樣品后,予生物素化的二級(jí)抗體和抗生物素蛋白-生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物孵育,蘇木精復(fù)染載玻片。采用圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組小鼠蔗糖偏好比較 慢性應(yīng)激組小鼠蔗糖偏好明顯低于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠蔗糖偏好均高于慢性應(yīng)激組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

        表1 各組小鼠蔗糖偏好比較(%)

        2.2 各組小鼠穿越次數(shù)、修飾次數(shù)比較 慢性應(yīng)激組小鼠穿越次數(shù)、修飾次數(shù)明顯低于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠穿越次數(shù)、修飾次數(shù)高于慢性應(yīng)激組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

        表2 各組小鼠穿越次數(shù)和修飾次數(shù)比較(次)

        2.3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較 慢性應(yīng)激組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均短于慢性應(yīng)激組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

        表3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間與強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較(min)

        2.4 各組小鼠炎癥細(xì)胞因子水平比較 慢性應(yīng)激組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)高于正常組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β均低于慢性應(yīng)激組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

        表4 各組小鼠炎癥細(xì)胞因子水平比較(pg/mg)

        2.5 各組小鼠RIP140/NF-κB相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)比較 由圖1可知,與正常組小鼠比較,慢性應(yīng)激組小鼠海馬組織中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與慢性應(yīng)激組小鼠比較,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組和氟西汀組小鼠海馬組織RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

        A:正常組;B:慢性應(yīng)激組;C:氟西汀組;D:柴胡皂苷D低劑量組;E:柴胡皂苷D高劑量組

        2.6 各組小鼠RIP140蛋白表達(dá)比較 與正常組小鼠比較,慢性應(yīng)激組小鼠海馬組織中RIP140蛋白表達(dá)上調(diào);與慢性應(yīng)激組小鼠比較,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組小鼠海馬組織中RIP140蛋白表達(dá)下調(diào)(圖2)。

        A:正常組;B:慢性應(yīng)激組;C:氟西汀組;D:柴胡皂苷D低劑量組;E:柴胡皂苷D高劑量組

        3 討 論

        中醫(yī)將焦慮癥歸屬于“郁病”范疇,并與“驚悸”“奔豚”“怔忡”等存在一定聯(lián)系[12]。焦慮癥屬于中醫(yī)情志疾病,與肝、心、腎、膽、脾等臟腑關(guān)系密切,以肝失疏泄、肝郁氣滯、心脾失養(yǎng)、陰陽(yáng)氣血失調(diào)為主要病機(jī)。柴胡具有疏肝理氣、解郁活血的功效,臨床常用于肝郁氣滯證,代表方劑為柴胡疏肝散[13]。分析中藥復(fù)方治療焦慮癥的用藥規(guī)律,中藥柴胡出現(xiàn)頻次位列第四[14]。研究表明柴胡加龍骨牡蠣湯可改善廣泛性焦慮癥患者癥狀[15],并發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制與柴胡加龍骨牡蠣湯可以改善曠野實(shí)驗(yàn)、迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)分,抑制核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),減少炎癥因子釋放有關(guān)[16]。

        現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,神經(jīng)炎癥在焦慮癥中起著重要作用[17]。TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎細(xì)胞因子在情緒行為和神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)中起重要作用,且有研究證實(shí),IL-1β參與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié),因此檢測(cè)小鼠海馬組織促炎細(xì)胞因子濃度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,慢性應(yīng)激組小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平均有不同程度的升高,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組、氟西汀組均降低了慢性應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平。

        RIP140蛋白是介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要因素。RIP140蛋白可激活促炎細(xì)胞因子生成,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥進(jìn)程,進(jìn)一步與NF-κB或環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白相互作用。此外,NF-κB抑制蛋白的磷酸化觸發(fā)NF-κB的激活,促進(jìn)促炎基因的轉(zhuǎn)錄和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)[18]。本研究結(jié)果顯示,柴胡皂苷D低劑量組、柴胡皂苷D高劑量組、氟西汀組均降低慢性應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型小鼠海馬組織中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白表達(dá)水平。

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