董宏丹

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽 110022)

結(jié)腸癌包括腺癌、未分化癌、黏液腺癌三種病理類型，常見于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，與直腸癌統(tǒng)稱為大腸癌，為常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。40～50歲是結(jié)腸癌的高發(fā)年齡段，流行病學(xué)資料顯示，全球范圍內(nèi)，每年約有120多萬新增結(jié)腸癌患者，并有約60萬人因該病死亡[2]，我國的發(fā)病率約為29.44/10萬[3]，雖然較歐美國家低，但近年來隨著人們生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)改變以及人口老齡化等因素，發(fā)病率和病死率也呈逐年上升趨勢，給人們的生命健康造成的威脅不容小覷。結(jié)腸癌起病隱匿，往往發(fā)現(xiàn)時病情已經(jīng)進(jìn)展至中晚期，加大了治療的難度。本病以手術(shù)治療為主，輔以化療、放療等綜合療法[4]，但由于腫瘤耐藥性、藥物不良反應(yīng)、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象存在，導(dǎo)致患者治療后5年生存率僅為50%左右[5]，療效不甚理想。因此，醫(yī)學(xué)界致力于尋求更為安全、有效的抗腫瘤方案。有研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在減輕放化療相關(guān)不良反應(yīng)、改善癥狀、延長患者生存期等方面效果較好[6]。黃芩苷是中藥黃芩中的活性成分，Wang等[7]的體外研究表明，黃芩苷具有抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡的作用。本研究主要探討黃芩苷對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞移植瘤小鼠白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)/轉(zhuǎn)錄活化因子-3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究動物：96只SPF級健康雄性昆明種小鼠，6～7周齡，體重18～22 g、平均(21.13±1.84)g，動物許可證號[SCXK(京)2014-0006]，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司。將所有小鼠于層流柜內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，溫度設(shè)定在(25±3)℃、濕度設(shè)定在(50±10)%，控制噪音<55 dB，氨濃度<10 ppm，每日光照時間為10 h，飼以充足的滅菌普通標(biāo)準(zhǔn)飼料及酸化水，小鼠自由活動，定時更換墊料、消毒。適應(yīng)性飼養(yǎng)時間為1周。

1.1.2 主要材料與試劑：HT-29人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞株(南京科佰生物科技有限公司)；氟尿嘧啶注射液(規(guī)格 0.25 g/支，國藥準(zhǔn)字H21021858)，使用時采用無菌生理鹽水配制成濃度為2 mg/ml的氟尿嘧啶溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；DMEM培養(yǎng)液(廈門研科生物技術(shù)有限公司)；ELISA檢測試劑盒(孟成科技有限公司)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素標(biāo)記dUTP缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)一站式檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；細(xì)胞裂解液(上海浩然生物技術(shù)有限公司)；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒(北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒(北京紐樸生物技術(shù)有限公司)；SDS-PAGE蛋白加樣緩沖液(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；磷酸緩沖液、吐溫20TBS緩沖液、5%脫脂牛奶(上海雅吉生物科技有限公司)；小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(上海恒斐生物科技有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備：MIKRO 220R型離心機(Hettich公司，德國)、SDSGA9000型全自動石蠟切片機(Diapath公司，意大利)、全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(Tecan公司，瑞士)、DMi8型熒光顯微鏡及配套成像分析系統(tǒng)(Leica公司，德國)、Powerpac型電泳儀(Bio-rad公司，美國)、QUN-S2000型全自動凝膠成像系統(tǒng)(上海啟洵儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芩苷：CAS號21967-41-9、純度≥97%、規(guī)格5 g/支、貨號981722，購自重慶普立科生物技術(shù)有限公司，使用時經(jīng)60 ℃無菌生理鹽水溶解并稀釋后冷卻，分別配制成濃度為2.5、5、10 mg/ml的黃芩苷溶液，保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 細(xì)胞懸液制備：取出復(fù)蘇好的處于對數(shù)生長期的HT-29人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞，滴加0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，1200 r/min，離心10 min，取細(xì)胞沉淀進(jìn)行洗滌，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度，制備濃度為2.5×107個/ml的HT-29人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞懸液。

1.2.3 建模、分組及給藥[8]：將經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)的小鼠隨機分為對照組16只、造模組80只。于右前肢腋窩處，造模組皮下注射2.5×107個/ml的HT-29人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞懸液0.2 ml，對照組皮下注射滅菌生理鹽水0.2 ml；繼續(xù)飼養(yǎng)5 d后觀察，若小鼠右前肢腋窩處有明顯腫瘤結(jié)節(jié)生長，即為結(jié)腸癌移植瘤模型建立成功；對于造模組意外死亡或最終未能成功建立模型的小鼠及時補齊。模型建立第2天，將造模組小鼠隨機分為模型組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及陽性對照組，各16只。模型組和對照組分別給予無菌生理鹽水10 ml/kg，1 次/d，腹腔注射；黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組分別給予2.5、5、10 mg/ml的黃芩苷溶液10 ml/kg，1次/d，腹腔注射；陽性對照組予以2 mg/ml的氟尿嘧啶溶液10 ml/kg,1次/d，腹腔注射。各組小鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.2.4 標(biāo)本采集與處理：末次給藥后第2天稱重，之后自眼眶采血2 ml，室溫靜置30 min，采用離心機3000 r/min、離心10 min，分離血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)錂z；斷頭處死小鼠，將腫瘤組織完整摘取，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a)、垂直橫徑(b)，電子天平測定腫瘤質(zhì)量，對照組則切取右前肢腋窩處等量皮下正常組織；取1/2小鼠腫瘤組織(對照組取正常組織)采用4%多聚甲醛固定，之后常規(guī)采用梯度濃度酒精脫水以及石蠟包埋，并用石蠟切片機制成組織切片，厚度為4 μm左右；另外1/2腫瘤組織(對照組正常組織)采用液氮速凍，之后于-70 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測。

1.2.5 腫瘤體積、質(zhì)量及抑瘤率檢測[9]：檢測各組小鼠腫瘤體積、質(zhì)量及抑瘤率。腫瘤體積=0.52×a×b2；抑瘤率=(模型組平均腫瘤質(zhì)量-用藥組平均腫瘤質(zhì)量)/模型組平均腫瘤質(zhì)量×100%。

1.2.6 TUNEL法測定小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)[10]:將1.2.4中制備的腫瘤組織石蠟切片取出，分別浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液10 min以脫蠟，然后分別浸入100%乙醇5 min、90%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸餾水2 min，至切片水化。室溫下，將切片浸入20 μg/ml蛋白酶K工作液中30 min以消化蛋白，PBS沖洗5 min×3次，之后按照試劑盒說明配制TUNEL檢測液(含TdT酶和熒光標(biāo)記液)，在37 ℃暗室內(nèi)，于切片上滴加TUNEL檢測液50 μl、孵育60 min、 PBS沖洗5 min×3次，抗熒光淬滅封片液封片，最后采用顯微鏡觀察。在熒光顯微鏡下對切片進(jìn)行觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕黃色，每張切片隨機選擇5個不重復(fù)視野進(jìn)行拍照，之后采用成像分析系統(tǒng)檢測每個視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)目以及凋亡細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptosis index，AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%，計算腫瘤組織AI，并取平均值。

1.2.7 ELISA法測定小鼠血清IL-6、IL-10水平：將步驟1.2.4中制備的血清取出，37 ℃恒溫水浴融化至室溫，采用全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)，嚴(yán)格參照ELISA檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，測定血清IL-6、IL-10水平。

1.2.8 Western blot法測定小鼠腫瘤組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平[10]：將1.2.3中凍存的腫瘤組織及對照組正常組織取出，用液氮研磨粉碎，加入含甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解液1 ml充分勻漿，于冰上裂解20 min，4 ℃條件下，15000 r/min、離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明采用BCA法測定總蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠(12%分離膠、5%濃縮膠)并灌注于電泳儀內(nèi)，然后將樣品蛋白與5×加樣緩沖液按4∶1體積混勻，上樣；開始電泳，至溴酚蘭跑至凝膠底部；之后將凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上，置于5%脫脂牛奶內(nèi)封閉2 h；4 ℃條件下，將NC膜分別置于IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2及內(nèi)參β-actin一抗工作液內(nèi)(1∶1000稀釋)，孵育16 h、TBST漂洗10 min×3次；室溫條件下，將NC膜置于HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液(1∶1000稀釋)內(nèi)，孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次；采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室內(nèi)進(jìn)行曝光、顯影、定影，晾干膠片。采用全自動凝膠成像系統(tǒng)對膠片進(jìn)行掃描、拍照，用Image J圖像處理軟件測定各目的蛋白條帶的灰度值(A)，計算IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白A值與內(nèi)參β-actin A值的比值，分析各目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、質(zhì)量和抑瘤率比較 與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及陽性對照組小鼠腫瘤體積、質(zhì)量均低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。黃芩苷高劑量組和陽性對照組抑瘤率高于黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腫瘤體積、質(zhì)量和抑瘤率比較

2.2 各組小鼠腫瘤組織AI比較 模型組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及陽性對照組小鼠腫瘤組織AI分別為(1.27±0.13)%、(24.56±2.68)%、(59.83±3.27)%、(78.34±3.65)%和(79.09±3.58)%，且黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對照組的腫瘤組織AI與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。各組TUNEL法檢測結(jié)果見圖1。

A:模型組；B:黃芩苷低劑量組；C:黃芩苷中劑量組；D:黃芩苷高劑量組；E：陽性對照組

2.3 各組小鼠血清IL-6、IL-10水平比較 與對照組比較，其余各組小鼠血清IL-6、IL-10水平均升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及陽性對照組小鼠血清IL-6、IL-10水平較低，且各黃芩苷組呈一定量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清IL-6、IL-10水平比較(pg/ml)

2.4 各組小鼠腫瘤組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組小鼠腫瘤組織IL-6、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷中劑量組、黃芩苷高劑量組及陽性對照組小鼠腫瘤組織IL-6、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平較低，且各黃芩苷組呈一定量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。各組間腫瘤組織STAT3 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3(圖2)。

表3 各組小鼠腫瘤組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

A:對照組；B:模型組；C:黃芩苷低劑量組；D:黃芩苷中劑量組；E：黃芩苷高劑量組；F：陽性對照組

3 討 論

CRC發(fā)病率居于惡性腫瘤的第三位，且發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為社會公共健康中的一大難題。手術(shù)、化療等治療方案受到患者病情、耐受性、腫瘤細(xì)胞耐藥等因素的影響，在治療效果上受到限制，而中醫(yī)中藥具有多途徑、多靶點發(fā)揮治療作用的特點，在惡性腫瘤的治療中往往能發(fā)揮減毒增效、改善生存質(zhì)量等作用，故日益受到醫(yī)學(xué)界關(guān)注。中醫(yī)認(rèn)為，結(jié)腸癌屬“腸覃”“腸癖”“鎖肛痔”“積聚”等范疇，病位在大腸，主要病機為正氣不足、濕熱蘊結(jié)、瘀毒內(nèi)阻，治療上也以清熱化濕、化瘀解毒為主[11]。黃芩味苦、性寒，有清熱燥濕、解毒之效，是結(jié)腸癌治療中常用的中藥，黃芩苷具有抗腫瘤、抗菌、肝臟保護、抗炎癥反應(yīng)、抗人類免疫缺陷病毒-1活性、糖尿病腎病保護、抗哮喘、保護腦缺血再灌注損傷等多種藥理作用[12-13]，在肝炎、腎炎、過敏性疾病等的治療中均取得了較好的療效。許聰?shù)萚14]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以通過逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性、細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制新生血管形成等途徑控制腫瘤發(fā)展，對肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞均有效果，抗癌作用廣泛。

此次研究中，筆者分別采用不同劑量的黃芩苷對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞移植瘤小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能使小鼠腫瘤體積和質(zhì)量均低于模型組，并且黃芩苷劑量越高抑瘤率越高，提示黃芩苷能夠發(fā)揮較好的抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞移植瘤生長作用，而且藥物濃度越高抗腫瘤效果越明顯。TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能提高小鼠腫瘤組織的AI，且黃芩苷高劑量組和陽性對照組腫瘤組織AI最高，表明黃芩苷對腫瘤組織細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。

凋亡異常、細(xì)胞失控性增殖是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療惡性腫瘤的重要途徑[15]，也是許多抗腫瘤藥物作用的最終靶點。腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡異常的信號通路有很多，此次主要研究黃芩苷對IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。IL-6為多功能的前炎癥細(xì)胞因子，可以由包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞合成釋放，不僅能夠參與炎癥反應(yīng)，還有抗腫瘤凋亡作用[16]。IL-6能夠與其可溶性受體IL-6R結(jié)合，使細(xì)胞表面IL-6受體的β亞基和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子gp130活化，并進(jìn)一步激活STAT3。STAT3為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、新生血管形成等，其異常持續(xù)激活能夠引起細(xì)胞增殖、凋亡失衡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[17-18]。Bcl-2是STAT3常見的下游基因，具有抗細(xì)胞凋亡作用，STAT3過度激活能夠使Bcl-2處于異常高表達(dá)狀態(tài)，致使腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制STAT3磷酸化、調(diào)節(jié)IL-6/ STAT3信號通路活性，能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖并誘導(dǎo)其凋亡[19-23]。本研究結(jié)果顯示，高劑量黃芩苷能夠有效降低血清及腫瘤組織IL-6類細(xì)胞因子表達(dá)，抑制STAT3激活，進(jìn)而下調(diào)Bcl-2表達(dá)，這可能是黃芩苷促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤的作用機制之一。魏國麗等[24]的體外研究也發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能下調(diào)STAT3信號通路、影響B(tài)cl-2家族成員表達(dá)，抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用，這與本研究結(jié)果有相似之處。

綜上所述，黃芩苷能劑量依賴性的抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞移植瘤小鼠腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用可能與抑制IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性有關(guān)。