李貴蘭，陸麗平，饒曉松

結(jié)直腸癌的發(fā)病率、病死率均較高，腺癌是其常見(jiàn)類型，根據(jù)其組織病理學(xué)特點(diǎn)可將腺癌分為多種亞型，其中黏液性結(jié)直腸腺癌(mucinous colorectal adenocarcinoma, MCA)占結(jié)直腸腺癌的15%～20%，與非黏液性結(jié)直腸腺癌(non-mucinous colorectal adenocarcinoma, non-MCA)相比，MCA分化程度低且惡性度高，MCA患者常表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，手術(shù)和化療后效果不佳，預(yù)后較差[1]。近年免疫檢查抑制劑在癌癥免疫療法中備受關(guān)注，應(yīng)用程序性死亡蛋白-1(programmed death protein-1, PD-1)或程序性死亡蛋白-配體1(programmed death protein-ligand 1, PD-L1)抑制劑的免疫療法已成為治療惡性腫瘤的有效手段，如非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤等[2-5]。在惡性腫瘤組織中PD-L1通過(guò)結(jié)合T細(xì)胞上的PD-1能抑制宿主T細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的免疫反應(yīng)[4-5]。PD-L1發(fā)揮作用與T細(xì)胞密切相關(guān)，特別是抗腫瘤CD8+T細(xì)胞，PD-L1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是新輔助化療治療局部晚期直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵標(biāo)志物[6]。本文應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)MCA和non-MCA中PD-L1和CD8的表達(dá)，探討兩者之間是否存在差異，以期為臨床免疫療法提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年6月北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者106例，其中non-MCA 90例，MCA 16例，所有患者無(wú)免疫系統(tǒng)疾病，未合并其他腫瘤，術(shù)前均未接受治療。查閱患者臨床病理資料，男性68例，女性38例，年齡40～80歲，≤50歲者35例，>50歲者71例。

1.2 免疫組化鼠抗人PD-L1購(gòu)自Gene Tech公司，鼠抗人MLH1購(gòu)自徠卡公司，鼠抗人CD8、MSH2、MSH6、PMS2均購(gòu)自北京中杉金橋公司，阿辛藍(lán)/PAS染色試劑盒購(gòu)自珠海貝索生物公司。應(yīng)用徠卡全自動(dòng)免疫組化儀(BOND-MAX，徠卡公司，德國(guó))進(jìn)行PD-L1、CD8、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2染色，免疫組化染色采用EnVision兩步法。

1.3 結(jié)果判定本組分別評(píng)估腫瘤細(xì)胞與腫瘤間質(zhì)中PD-L1的免疫組化染色結(jié)果，腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為僅有細(xì)胞膜染色(無(wú)論完整與否以及染色強(qiáng)度)。腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞)的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)著色均判為陽(yáng)性：PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞≥5%為陽(yáng)性[7]。計(jì)算腫瘤組織中PD-L1陽(yáng)性率的均數(shù)，高于均數(shù)為高表達(dá)，低于均數(shù)為低表達(dá)。200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)10 000 μm2腫瘤間質(zhì)中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算其均數(shù)，即代表為該腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)量，再計(jì)算腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞數(shù)量的均數(shù)，高于均數(shù)為CD8高表達(dá)，低于均數(shù)為低表達(dá)。檢測(cè)腫瘤錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表達(dá)，其中≥1項(xiàng)陰性則判定腫瘤為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)，而MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均陽(yáng)性則判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability, MSS)。

2 結(jié)果

2.1 MCA與non-MCA組織學(xué)特征MCA表現(xiàn)為腸壁內(nèi)不規(guī)則腺體浸潤(rùn)，腺腔內(nèi)外充滿黏液，腫瘤細(xì)胞核大深染，異型性明顯；non-MCA表現(xiàn)為腸壁內(nèi)不規(guī)則腺體浸潤(rùn)，腺腔內(nèi)無(wú)或含少量黏液，間質(zhì)炎細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞核大，空泡狀，核仁明顯，可見(jiàn)核分裂象(圖1、2)。MCA組與non-MCA組相比，其內(nèi)含大量黏液，占腫瘤組織面積的50%以上(圖3、4)。

①②③④⑤⑥⑦A⑦B

2.2 MCA與non-MCA組織中PD-L1的表達(dá)兩組腫瘤組織中PD-L1多表達(dá)于腫瘤間質(zhì)的免疫細(xì)胞(圖5、6)。本組僅7例腫瘤組織的癌細(xì)胞中有PD-L1表達(dá)，占總標(biāo)本的6.6%，且在腫瘤細(xì)胞中占比較小(<1%腫瘤細(xì)胞)，腫瘤細(xì)胞呈乳頭狀生長(zhǎng)，間質(zhì)血管豐富，擴(kuò)張充血，腫瘤細(xì)胞呈假?gòu)?fù)層結(jié)構(gòu)排列，核呈長(zhǎng)橢圓形，空泡狀，核仁明顯，胞質(zhì)粉染(圖7)。本組non-MCA組織中PD-L1表達(dá)高于MCA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖8)。

圖8 黏液性結(jié)直腸腺癌(MCA)與非黏液性結(jié)直腸腺癌(non-MCA)組織中PD-L1的表達(dá)

2.3 MCA與non-MCA組織中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，在non-MCA組織中23%的PD-L1和CD8同時(shí)高表達(dá)，48%的PD-L1和CD8同時(shí)低表達(dá)，7%的PD-L1高表達(dá)和CD8低表達(dá)，22%的PD-L1低表達(dá)和CD8高表達(dá)。在MCA組織中有40%的PD-L1和CD8同時(shí)低表達(dá)，60%的PD-L1低表達(dá)而CD8高表達(dá)。

2.4 MCA與non-MCA組織中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)本組non-MCA組織的單位面積腫瘤間質(zhì)中CD8+T細(xì)胞數(shù)量為15.3，MCA組織為9.2，盡管non-MCA組CD8+T細(xì)胞數(shù)量的絕對(duì)值高于MCA組，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9)。

圖9 黏液性結(jié)直腸腺癌(MCA)與非黏液性結(jié)直腸腺癌(non-MCA)組織中CD8+ T細(xì)胞的表達(dá)

2.5 MCA與non-MCA組織中的MSI和MSS本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD-L1陽(yáng)性的non-MCA中有11%為MSI，89%為MSS；PD-L1陽(yáng)性的MCA中有14%為MSI，86%為MSS。另外，本組還分析PD-L1陽(yáng)性的結(jié)直腸腺癌的發(fā)生部位，其中50%為直腸，25%為乙狀結(jié)腸，13%為升結(jié)腸，4%為橫結(jié)腸，5%為降結(jié)腸，3%為全結(jié)腸。

3 討論

結(jié)直腸癌為消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率較高[1,8]。MCA作為結(jié)直腸腺癌的亞型之一，與non-MCA相比，具有分化程度低，惡性度高，易轉(zhuǎn)移，手術(shù)和化療后的治療效果不理想，預(yù)后較差等特點(diǎn)[1]。研究MCA與non-MCA分子表型差異，將為結(jié)直腸腺癌的治療及預(yù)后評(píng)估等提供線索。目前手術(shù)、化療和放療是治療結(jié)直腸癌的主要方法。近年腫瘤微環(huán)境越來(lái)越受重視，研究腫瘤細(xì)胞和免疫微環(huán)境之間的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注。應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑調(diào)節(jié)免疫功能逐漸成為一種新興的治療方法[2,9]，該療法被應(yīng)用于晚期腫瘤患者、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移患者以及不適合一線多藥物化療的患者[9]。文獻(xiàn)報(bào)道PD-L1陽(yáng)性的腫瘤對(duì)于抗PD-1/PD-L1治療表現(xiàn)出更強(qiáng)的敏感性，且療效更好，提示檢測(cè)腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)對(duì)于預(yù)測(cè)免疫治療效果有一定的價(jià)值[2,9-11]。本組實(shí)驗(yàn)探討MCA和non-MCA的腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)中相關(guān)免疫細(xì)胞PD-L1的表達(dá)及差異，結(jié)果顯示：不同于非小細(xì)胞肺癌及腎細(xì)胞癌等，結(jié)直腸腺癌中PD-L1主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)的免疫細(xì)胞，且non-MCA組織中PD-L1表達(dá)比MCA高。結(jié)合文獻(xiàn)和本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明non-MCA患者應(yīng)用PD-L1/PD-1抑制劑的效果可能優(yōu)于MCA患者，但實(shí)際臨床效果需進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，在肺癌和卵巢癌中亦發(fā)現(xiàn)，黏液性肺癌和黏液性卵巢癌中PD-L1表達(dá)比非黏液性肺癌和卵巢癌低[12-13]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)缺失，而腫瘤間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PD-L1的小鼠中，應(yīng)用PD-L1/PD-1抑制劑依然能抑制腫瘤的免疫逃逸反應(yīng)，提示腫瘤間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PD-L1在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[14]。有研究表明巨噬細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)PD-L1與T淋巴細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞增殖和活化，并誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用下降，引起腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[15]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)直腸腺癌中PD-L1主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)的免疫細(xì)胞，應(yīng)用PD-L1/PD-1抑制劑治療結(jié)直腸癌的相關(guān)機(jī)制值得深入探究。

CD8+T細(xì)胞的表達(dá)多用來(lái)評(píng)估癌癥患者預(yù)后，PD-L1與CD8+T細(xì)胞在腫瘤組織中高表達(dá)提示對(duì)PD-L1/PD-1抑制劑敏感性更強(qiáng)，預(yù)后較好[16]。本組non-MCA中有23%的PD-L1和CD8同時(shí)高表達(dá)，MCA中PD-L1表達(dá)均較低。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中PD-L1 mRNA表達(dá)與γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)基因表達(dá)有關(guān)，T細(xì)胞分泌的IFN-γ能促進(jìn)活化的免疫細(xì)胞表達(dá)PD-L1[17]。但依然有7%的non-MCA組織中PD-L1高表達(dá)和CD8低表達(dá)，22%的PD-L1低表達(dá)和CD8高表達(dá)，這表明PD-L1表達(dá)和調(diào)控還受其它因素影響。

盡管目前研究結(jié)果顯示，對(duì)于結(jié)直腸腺癌，PD-1/PD-L1抑制劑主要在MSI-H腫瘤中表現(xiàn)較好的療效[18]，但亦有研究表明細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)和PD-1/PD-L1雙重抑制對(duì)于治療MSS結(jié)直腸癌有一定療效[19]，研究顯示地西他濱能增強(qiáng)PD-1/PD-L1抑制劑治療MSS結(jié)直腸癌的作用[20]，這表明PD-1/PD-L1抑制劑用于治療MSS結(jié)直腸癌的應(yīng)用前景值得進(jìn)一步探索。此外，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD-L1陽(yáng)性的結(jié)直腸腺癌主要表達(dá)于直腸和乙狀結(jié)腸。

綜上所述，結(jié)直腸腺癌中PD-L1主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)的免疫細(xì)胞，進(jìn)一步研究免疫細(xì)胞PD-L1的作用機(jī)制及其表達(dá)和調(diào)控，將對(duì)應(yīng)用免疫療法治療結(jié)直腸腺癌提供重要理論基礎(chǔ)。