劉鳳磊，何 欣，梁小芹，常守鳳，王金穗，溫麗萍，衛(wèi)旭東

冷凍切片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床多年，要求病理醫(yī)師在患者手術(shù)中快速準(zhǔn)確的出具病理結(jié)果，為臨床醫(yī)師下一步治療提供依據(jù)，如明確甲狀腺病變良惡性，決定是否進(jìn)行根治性治療；甲狀腺微小乳頭狀癌前哨淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，決定是否清掃淋巴結(jié)。但由于診斷時(shí)間短、觀察受限、病變不典型等因素，部分病例難以在手術(shù)中獲得明確病理診斷，需等待術(shù)后石蠟切片的免疫組化染色來(lái)明確，增加患者二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。直接免疫組化染色法在冷凍切片上直接進(jìn)行，可在手術(shù)中協(xié)助判斷病變良惡性。本實(shí)驗(yàn)探討基于冷凍切片的直接免疫組化染色法在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年7～9月甘肅省人民醫(yī)院、甘肅省腫瘤醫(yī)院術(shù)中送檢的新鮮甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本30例(經(jīng)典亞型22例、濾泡亞型8例)，腫塊直徑0.2～3 cm，13例送檢了前哨淋巴結(jié)，10例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。男性13例，女性17例，年齡24～57歲，平均45歲。另收集30例良性甲狀腺病變組織(結(jié)節(jié)性增生17例、濾泡性腺瘤6例、淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎7例)作為對(duì)照，所有標(biāo)本均行冷凍切片及石蠟切片的病理診斷。

1.2 儀器與試劑德國(guó)Leica CM1950冷凍切片機(jī)；OCT組織包埋劑；蘇木精染液；1%鹽酸乙醇分化液；2%碳酸鋰返藍(lán)溶液；0.5%伊紅染液，梯度乙醇；二甲苯透明液；樹(shù)膠封片劑；直接免疫組化試劑盒及抗體Galectin-3(克隆號(hào)R105)、CK19(克隆號(hào)R1002)，購(gòu)自貴州美鑫達(dá)醫(yī)療科技公司。石蠟切片免疫組化染色采用EnVision兩步法；Roche BenchMark XT免疫組化染色機(jī)染色；抗體Galectin-3(克隆號(hào)9c4)、CK19(克隆號(hào)MX054)購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法術(shù)中腫瘤切除送至病理科，肉眼觀察后，病變部位取材，冷凍切片，參數(shù)為：箱體溫度-30 ℃，冷凍頭溫度-30 ℃，5 μm厚切片。組織樣本頭加冷凍包埋劑OCT，放組織標(biāo)本，切片染色流程及時(shí)間見(jiàn)表1。冷凍組織病理報(bào)告發(fā)出后，冷凍剩余組織流水解凍，除去包埋劑，10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋。Roche BenchMark XT染色機(jī)行石蠟切片免疫組化染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直接免疫組化染色與石蠟切片免疫組化染色時(shí)間對(duì)比分析直接免疫組化染色中，病變組織采用85%甲醇、10%甲醛、5%冰醋酸固定1 min，封閉，滴加一抗，顯色。流程約15 min。石蠟切片免疫組化采用Roche BenchMark XT染色機(jī)進(jìn)行，耗時(shí)280 min(表1)。兩組相比，冷凍切片直接免疫組化染色大幅縮短了時(shí)間。

表1 兩種免疫組化染色法流程及時(shí)間對(duì)比分析

2.2 直接免疫組化染色與石蠟切片免疫組化染色質(zhì)量對(duì)比分析直接免疫組化染色中，CK19、Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌中呈彌漫、連續(xù)的細(xì)胞胞質(zhì)陽(yáng)性(圖1、2)，在少部分病例的癌巢中呈斑駁的不均勻著色。甲狀腺良性病變中僅個(gè)別病例呈微弱陽(yáng)性著色。甲狀腺前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中CK19(圖3)、Galectin-3呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性，可發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移癌。石蠟切片免疫組化法采用Roche BenchMark XT機(jī)染色，細(xì)胞質(zhì)著色，染色鮮艷，細(xì)胞形態(tài)清晰，穩(wěn)定、可靠，質(zhì)量佳，兩種染色方法相比，染色質(zhì)量一致。

①A①B①C②A②B②C③

2.3 直接免疫組化染色與石蠟切片免疫組化染色結(jié)果對(duì)比分析直接免疫組化染色法中，CK19、Galectin-3在甲狀腺良性病變中的陽(yáng)性率為6.67%(2/30)、10%(3/30)，在甲狀腺乳頭狀癌中的陽(yáng)性率為96.67%(29/30)、93.33%(28/30)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。冷凍剩余甲狀腺乳頭狀癌組織行石蠟切片免疫組化法染色，Galectin-3、CK19的陽(yáng)性率為96.67%(29/30)、96.67%(29/30)，與直接免疫組化染色法近似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表2 甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺良性病變中CK19、Galectin-3的表達(dá)

表3 甲狀腺乳頭狀癌組織的兩種免疫組化染色法結(jié)果對(duì)比分析

2.4 甲狀腺前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的診斷準(zhǔn)確性評(píng)析10例甲狀腺前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織，冷凍切片的HE染色正確診斷6例(60.00%)，冷凍切片+直接免疫組化染色正確診斷10例(100%)，以術(shù)后病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，冷凍切片的直接免疫組化法準(zhǔn)確性?xún)?yōu)于單純HE染色，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表4 直接免疫組化染色法與單純HE染色診斷甲狀腺前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌正確率對(duì)比分析

3 討論

基于HE染色的形態(tài)學(xué)診斷有一定的局限性，存在漏診、誤診可能，如甲狀腺乳頭狀癌與乳頭狀增生，濾泡性腺瘤與濾泡亞型乳頭狀癌形態(tài)學(xué)改變類(lèi)似，鑒別診斷困難，病理醫(yī)師有時(shí)會(huì)出具描述性報(bào)告或延遲報(bào)告，等常規(guī)病理檢查結(jié)果確診[1-2]，增加了患者二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。

免疫組化染色應(yīng)用抗原、抗體結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使特異性蛋白顯色，以明確組織細(xì)胞的起源及性質(zhì)。傳統(tǒng)免疫組化染色基于石蠟包埋組織，不包括組織脫水、包埋、切片時(shí)間(約12 h)，僅單純免疫組化染色就需280 min才能完成，無(wú)法滿足術(shù)中快速病理診斷(<30 min)的要求。本實(shí)驗(yàn)采用基于冷凍切片的直接免疫組化染色法，與傳統(tǒng)的EnVision兩步法相比，無(wú)需添加二抗，省去了反應(yīng)步驟，節(jié)約時(shí)間；且冷凍切片組織固定時(shí)間短，分子內(nèi)或分子間的醛鍵尚未形成，抗原決定簇不會(huì)封閉，無(wú)需組織修復(fù)，節(jié)約時(shí)間，可以滿足術(shù)中快速冷凍切片對(duì)時(shí)間的要求。

研究顯示Galectin-3、CK19等抗體在甲狀腺乳頭狀癌中高表達(dá)，在良性病變中表達(dá)缺失，可作為診斷甲狀腺乳頭狀癌的特異性標(biāo)志物[3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用直接免疫組化法染色，發(fā)現(xiàn)Galectin-3、CK19在甲狀腺乳頭狀癌中的陽(yáng)性率顯著高于甲狀腺良性病變組織，說(shuō)明兩種抗體聯(lián)合檢測(cè)可在手術(shù)中區(qū)分甲狀腺乳頭狀癌和其他良性病變?；诶鋬銮衅闹苯用庖呓M化與傳統(tǒng)免疫組化染色相比，兩種抗體的陽(yáng)性率基本一致，兩種染色方法的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明直接免疫組化染色與傳統(tǒng)免疫組化染色的敏感性和特異性相當(dāng)，在甲狀腺乳頭狀癌診斷中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。如遇不典型病變，可適當(dāng)增加抗體種類(lèi)，如Cycnlin D1、MC、BRAF V600E、Ki-67等，增加術(shù)中冷凍切片診斷的準(zhǔn)確性。此項(xiàng)技術(shù)簡(jiǎn)單、方便、易操作，亦可區(qū)分其他難以鑒別的腫瘤，沈元龍等[4]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍切片的直接免疫組化染色較單純的HE染色可顯著提高硬化性肺泡細(xì)胞瘤和肺腺癌的診斷準(zhǔn)確率。還可在術(shù)中快速準(zhǔn)確的判斷非小細(xì)胞肺癌縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，使得Ⅰ期肺癌患者避免不必要的肺葉切除，縮少手術(shù)范圍[5]。本組甲狀腺前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織CK19、Galectin-3呈彌漫陽(yáng)性，可協(xié)助發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，提高前哨淋巴結(jié)診斷準(zhǔn)確率，優(yōu)于單純HE染色，降低了患者遭受二次手術(shù)或不必要的淋巴結(jié)清掃的風(fēng)險(xiǎn)。

本組實(shí)驗(yàn)的直接免疫組化染色質(zhì)量稍差于傳統(tǒng)染色，部分病例在癌巢中呈現(xiàn)斑駁的不均勻著色，可能有以下幾種原因：(1)直接免疫組化為純手工操作，標(biāo)準(zhǔn)化方面不及機(jī)染穩(wěn)定。(2)封閉液、PBS沖洗后樣本上的殘留液體未能完全甩干，造成抗體、DAB顯色液濃度被稀釋?zhuān)拾唏g不均勻著色。有研究報(bào)道，將直接免疫組化染色與Leica Bond自動(dòng)染色技術(shù)相結(jié)合，與手工染色相比，全自動(dòng)染色具有更好的穩(wěn)定性和較高的著色重現(xiàn)性[6]。隨著全自動(dòng)染色技術(shù)的成熟，該技術(shù)將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，基于冷凍切片的直接免疫組化染色法操作簡(jiǎn)單，制片時(shí)間短，染色結(jié)果穩(wěn)定可靠，應(yīng)用上述方法聯(lián)合檢測(cè)CK19、Galectin-3等甲狀腺乳頭狀癌的診斷標(biāo)志物，可顯著提高手術(shù)中診斷的準(zhǔn)確性，有助于發(fā)現(xiàn)前哨淋巴結(jié)的微小轉(zhuǎn)移灶，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。