曾 英，鐘 鵬，毛成毅，林 俐，杜 娟，付 萍，馬 瑜，肖華亮，郭喬楠

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人常見的惡性程度最高的腦腫瘤，其具有高度侵襲性，腫瘤極易復發(fā)，預后差。手術(shù)完整切除后輔以放、化療，GBM患者的中位總生存期(overall survival, OS)也僅為15～20個月[1]。因此，需要探尋新的治療靶位以改善患者預后。神經(jīng)降壓素(neurotensin, NTS)作為一種在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達的神經(jīng)肽，主要通過神經(jīng)降壓素受體1(neurotensin receptor 1, NTSR1)介導激活下游信號通路。NTSR1通過激活多種信號轉(zhuǎn)導，包括蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPKs)、c-jun-NH-激酶、Rho家族的鳥苷三磷酸酶(RhoGTPase)、黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)以及Wnt/β-catenin，促進細胞存活、增殖、遷移及侵襲[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)NTS和NTSR1在膠質(zhì)瘤組織中高表達，特別是在GBM，其表達和膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)，利用數(shù)據(jù)庫信息分析發(fā)現(xiàn)NTS和NTSR1表達預測膠質(zhì)瘤患者預后差[6]，是GBM患者預后的重要預測指標，然而其在組織樣本中的表達及與患者預后的關(guān)系尚不清楚，因此本實驗檢測GBM中NTSR1的表達，分析NTSR1與GBM分子分型、重要分子改變及預后之間的關(guān)系，探索NTSR1在GBM靶向治療中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010～2017年陸軍特色醫(yī)療中心/陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院病理科存檔的138例具有完整臨床和病理資料的GBM，根據(jù)WHO(2016)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，由高年資病理醫(yī)師復核組織切片。本實驗獲陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院倫理委員會批準(批準號2018-125)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集 通過查閱住院病歷及詢問患者收集患者的臨床資料，包括患者年齡、性別、病程、腫瘤發(fā)生部位、病變大小、主要癥狀、影像學特征、治療方法、治療效果和復發(fā)轉(zhuǎn)移等，并進行追蹤隨訪。隨訪開始以病例確診之日起計算，按月記錄。隨訪截止原因有：死亡、中途失訪或隨訪截止(2019年6月)。

1.2.2組織芯片制備 選取腫瘤組織，HE切片由2名主治及以上職稱醫(yī)師分別評片，避開壞死及變性部位，選取腫瘤細胞富集區(qū)，并圈注；融蠟，制備空白蠟塊；設(shè)計點位組織陣列；加載設(shè)計圖標，啟動組織芯片制作程序，將一個空白受體蠟塊置于組織芯片儀1號位，其余按設(shè)計順序從2～8依次放置并全部鎖緊。對選擇區(qū)域依次拍照，后通過調(diào)整取樣針依次取出空白蠟，填加選取的腫瘤組織芯。最后將填好組織芯的受體蠟塊放置于模具中，輕壓蠟塊使組織芯在模具中處于同一平面。將模具置于65 ℃組織芯片融合臺上融合15 min，冷卻后取下，常規(guī)切片，備用。

1.2.3免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法染色，抗原標記NTSR1、CHI3L1購自O(shè)rigen公司，IDH1R132H(H09)、ATRX、p53、Ki-67和CD44(DF1485)購自福州邁新公司，EGFR、PTEN、vimentin購自北京中杉金橋公司。結(jié)果判斷以出現(xiàn)腫瘤細胞表達為陽性。NTSR1抗體以肺腺癌組織作為陽性對照，其余抗體設(shè)置相應(yīng)陽性對照，以PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)代替一抗作為空白對照。

1.2.4GBM分子分型 根據(jù)文獻[7]報道的方法并加以優(yōu)化，用于GBM分子分型：IDH1陽性，歸為前神經(jīng)元型；IDH1陰性，EGFR高表達，歸為經(jīng)典型；IDH1、EGFR陰性，2個以上間葉標志物高表達(PTEN、vimentin、CHI3L1、CD44)，歸為間葉型；IDH1、EGFR和間葉標志物均陰性，歸為其他/不能分類。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組與多組間構(gòu)成比比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。一致性檢驗(Kappa檢驗)分析不同蛋白表達的相關(guān)性。不同蛋白表達組患者的總生存采用Kaplan-Meier法，并用對數(shù)秩檢驗(Log-rank test)比較組間生存時間差異；單因素和多因素Cox生存回歸分析與OS相關(guān)的預后因素。檢驗水準P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征138例GBM患者平均年齡61.4歲，中位年齡53歲；男性74例，女性64例，男女比為1.16 ∶1；幕上好發(fā)，幕下罕見，額葉、顳葉好發(fā)，約26.08%的患者累及2葉；以頭昏頭痛、嘔吐等為主要癥狀，23.19%的患者復發(fā)，中位無進展生存期(progression free survival, PFS)為6.0個月，中位OS為9.0個月。

2.2 免疫表型及分子分型免疫組化顯示ATRX陽性定位于細胞核，細胞核表達缺失提示ATRX突變(圖1)，核陽性提示ATRX保留，腫瘤周圍組織可見ATRX表達；IDH1陽性信號位于細胞質(zhì)(圖2)，提示為IDH1突變型GBM；瘤細胞胞質(zhì)未見IDH1表達，提示為IDH1野生型GBM，腫瘤周圍組織未見IDH1表達；p53表達定位于細胞核，彌漫表達提示p53陽性(圖3)，散在強弱不等表達提示p53陰性(野生型)，腫瘤周圍組織p53陰性。138例GBM中，IDH1陽性9例，ATRX缺失27例，p53陽性52例。

①②③④⑤⑥⑦⑧

EGFR陽性信號定位于細胞膜和高爾基體(圖4)，CD44陽性信號定位于細胞膜和高爾基體(圖5)，CHI3L1陽性信號位于細胞質(zhì)和高爾基體(圖6)。腫瘤周圍組織EGFR、CD44、CHI3L1弱陽性。138例GBM中，IDH1陽性9例，EGFR彌漫陽性46例，CHI3L1陽性66例，根據(jù)IDH1、EGFR、CD44、CHI3L1表達結(jié)果，對138例GBM進行分子分型：間葉型66例(47.8%)，經(jīng)典型46例(33.3%)，前神經(jīng)元型9例(6.5%)，其他/不能分類17例(12.3%)，分型率為87.7%(121/138)。

2.3 NTSR1與GBM分子分型的關(guān)系免疫組化染色顯示NTSR1陽性定位于細胞膜、細胞質(zhì)(圖7)，腫瘤周圍組織中陰性(圖8)。138例GBM中NTSR1陽性80例，NTSR1在GBM分子亞型中的表達差異有顯著性(P=0.003，表1)，在經(jīng)典型、間葉型、前神經(jīng)元型和其他/不能確定類型的陽性率分別是67.4%、63.6%、11.1%和35.3%。

2.4 GBM中NTSR1與IDH1、ATRX、p53表達的相關(guān)性IDH1的陽性率為6.5%(9/138)，NTSR1在IDH1突變型GBM中陽性率為11.1%(1/9)，NTSR1在IDH1野生型GBM中的陽性率為62.0%(79/129)，NTSR1與IDH1表達呈負相關(guān)(P=0.001)；ATRX表達缺失率為19.6%(27/138)，ATRX表達(保留)率為80.4%(111/138)，NTSR1與ATRX表達呈正相關(guān)(P=0.043)；p53陽性率為37.7%(52/138)，NTSR1與p53表達無相關(guān)性(P=0.263，表1)。

表1 NTSR1與膠質(zhì)母細胞瘤分子亞型、IDH1、ATRX、p53表達的關(guān)系

2.5 預后分析138例GBM預后分析結(jié)果顯示：患者性別(Log-rank=0.050，P=0.823)、p53表達(Log-rank=2.815，P=0.093)與OS無相關(guān)性?；颊吣挲g與OS有相關(guān)性(Log-rank=4.300，P=0.004)，患者年齡越大，死亡風險越高；治療方式與OS有相關(guān)性(Log-rank=52.893，P<0.001)，采取手術(shù)治療患者的中位OS為6個月，手術(shù)+放療/化療患者的中位OS是11個月，手術(shù)+化療+放療患者的中位OS是32個月(圖9A)。上述結(jié)果提示，采取手術(shù)+放療+化療的治療方式的患者預后最好。

此外，分子亞型與OS有相關(guān)性(Log-rank=9.971，P=0.019，圖9B)，前神經(jīng)元型、經(jīng)典型、間葉型、其他/不能分類的中位OS分別是39、10、9、17個月。IDH1與OS有相關(guān)性(Log-rank=6.189，P=0.013)，IDH1突變型和IDH1野生型患者的中位OS分別是39、10個月(圖9C)。ATRX與OS有相關(guān)性(Log-rank=5.130，P=0.024，表2)，ATRX缺失和陽性患者的中位OS分別是17.0和10.0個月。NTSR1陰性與陽性患者的中位OS分別為17個月和9個月，兩組間OS差異有顯著性(P=0.008，表2，圖9D)。單因素Cox回歸分析結(jié)果亦表明，NTSR1陽性患者較NTSR1陰性患者死亡風險顯著增加；患者年齡(P=0.004)、治療方式(P<0.001)和IDH1(P=0.022)、分子亞型(P=0.006)是預后相關(guān)因素(表3)。

表2 Kaplan-Meier生存曲線分析膠質(zhì)母細胞瘤臨床病理特征與預后的關(guān)系

多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示：在年齡、性別、分子亞型、IDH1、ATRX、治療方式評分中，只有分子亞型(前神經(jīng)元型vs其他亞型)(P=0.008)、治療方式(手術(shù)+放療/化療vs手術(shù)，手術(shù)+放療+化療vs手術(shù)，P<0.001)是OS的獨立預后因素(表4)。

表4 多因素Cox回歸分析

3 討論

3.1 GBM臨床特征本組中GBM男女比為1.16 ∶1，低于美國的1.60，接近于瑞士的1.28 ∶1[8]；中位OS為9.0個月，低于文獻報道[8]，可能與47%患者僅接受手術(shù)治療，缺乏輔助放療與化療有關(guān)。

3.2 GBM異質(zhì)性與分子分型GBM是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，患者預后較差，從組織學到分子學均發(fā)現(xiàn)GBM腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性[9-10]。GBM具有不同組織病理亞型如上皮樣膠質(zhì)母細胞瘤及分子遺傳學特征(IDH1、ATRX基因改變等)[11]，其IDH1突變、ATRX突變?nèi)笔А?p/19q共缺失、TERT基因啟動子突變等與預后相關(guān)[12]。Verhaak等[13]將GBM分為4個基因亞型：間葉型、經(jīng)典型、神經(jīng)元型和前神經(jīng)元型，每種類型以特定基因差異為特征，預后為前神經(jīng)元型>神經(jīng)元型>經(jīng)典型>間葉型。盡管間葉型預后差，但其可能受益于免疫治療。將GBM進行分子分型對指導臨床預后有重要意義，最初的分子分型基于表達譜，其操作繁瑣、費用高，不利于臨床推廣。本實驗采用文獻[7]報道的免疫組化法對GBM進行分子分型，將138例GBM中的121例GBM分為間葉型、經(jīng)典型、前神經(jīng)元型，中位OS分別是9.0、10.0、39.0個月。與文獻報道的“不同分子分型對應(yīng)不同預后”一致，這證實了基于IDH1、EGFR、PTEN、CD44、CHI3L1標記進行分子分型的有效性，適用于臨床。對于不能分類的17例可進行測序或基因表達譜分析再進行分類。

ATRX、IDH1和TP53突變在星形細胞性膠質(zhì)瘤譜系早期發(fā)展和進展中起重要作用，也與治療和預后相關(guān)[14-16]。ATRX改變發(fā)生于絕大多數(shù)低級別星形細胞瘤和IDH1突變(繼發(fā)性)的GBM。ATRX、p53、IDH這三種生物標志物單獨或聯(lián)合應(yīng)用，可將GBM分為不同亞組，對成人GBM預后有很強的預測價值[14]。本實驗結(jié)果證實GBM患者OS與GBM分子亞型、IDH1、ATRX相關(guān)，前神經(jīng)元亞型較其他組預后好，IDH1突變、ATRX突變均提示患者預后好，但p53表達與預后無相關(guān)；分子亞型、治療方式是GBM獨立預后因素，前神經(jīng)元亞型提示患者預后良好，手術(shù)完整切除+輔助放、化療可明顯改善患者預后，新近研究發(fā)現(xiàn)電場治療可使患者的生存期延長至20個月[17]。另外，MGMT啟動子甲基化也是預后良好的因素[18]。

近來研究顯示，NTS/NTSR1在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)NTS及其受體NTSR1的表達與膠質(zhì)瘤病理學分級呈正相關(guān)，通過數(shù)據(jù)庫分析NTSR1是GBM患者預后的重要預測指標[6]。本實驗采用免疫組化法檢測NTSR1表達并分析NTSR1與OS的關(guān)系，證實NTSR1是GBM患者預后的重要預測指標，但并非獨立預后因素；NTSR1表達是GBM預后差的因素。NTSR1在IDH1突變型GBM中表達率極低，提示NTSR1信號在IDH1突變型GBM中處于失活狀態(tài)，突變的IDH1催化產(chǎn)生過量原癌代謝產(chǎn)物2-羥戊二酸，而非正常時的α-酮戊二酸，導致膠質(zhì)瘤超甲基化表型[19]，IDH1突變型GBM超甲基化使NTSR1處于失活狀態(tài)。文獻報道NTSR1高甲基化水平提示結(jié)直腸癌患者預后好，NTSR1低甲基化水平有助于腫瘤惡性潛能[20]；有研究亦顯示NTSR1啟動子甲基化可調(diào)控NTSR1表達和沉默[21-22]。NTSR1主要表達于IDH野生型GBM，NTSR1表達與IDH野生型、ATRX(保留)呈正相關(guān)，兩者均提示患者預后差。TP53體細胞突變在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮重要作用，特別是在低級別星形細胞瘤和IDH1突變型GBM。但本實驗發(fā)現(xiàn)NTSR1表達與p53表達無關(guān)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，NTSR1在各分子亞型間表達差異有顯著性，在經(jīng)典型和間葉型中的陽性率明顯高于前神經(jīng)元型和其他類型，經(jīng)典型和間葉型GBM較前神經(jīng)元型GBM預后差，提示NTSR1陽性患者預后差可能與分子亞型有關(guān)。經(jīng)典型GBM以EGFR高表達為特征，NTSR1在經(jīng)典型GBM中的陽性率為67.4%。EGFR信號通路反式激活是NTS信號在腫瘤進展中重要下游事件[23]。NTS/NTSR1可激活EGFR、HER-2和HER-3[23-24]，NTS誘導EGFR過表達和激活[25]。NTS信號活化EGFR信號，誘導IL-8分泌，維持GSC“干樣”特征[26]。作者推測在經(jīng)典型GBM中NTSR1可能通過活化EGFR信號通路起作用。NTSR1在間葉型GBM中的陽性率為63.6%。研究發(fā)現(xiàn)NTS/NTSR1共表達通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換和促進腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。在間葉型GBM中NTSR1活化可能通過Wnt/β-catenin信號通路起作用，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進腫瘤生長。

綜上可知，NTSR1表達與GBM分子分型、重要分子標志IDH1、ATRX有相關(guān)性，NTSR1表達是患者預后差的因素之一。分子分型、治療方式是GBM獨立的預后因素。