張偉偉 宋平 李婉珍 金偉豪 李航航 朱龍寶 葛飛 陶玉貴

(安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000)

黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗腫瘤等功效，是具有一定研究價值的活性化合物，大多數(shù)黃酮類化合物從植物中提取。大多數(shù)藥食同源植物都含有大量的黃酮類化合物，而且沒有被資源化利用。藥食同源的荸薺又稱馬蹄，不僅營養(yǎng)豐富，且具有多種活性物質[1,2]。據報道，馬蹄皮中含有大量的黃酮類活性物質，然而馬蹄加工成飲料后的果皮，未能得到合理利用，造成資源的極大浪費。目前國內對馬蹄皮的研究，主要集中于馬蹄果實的加工，近些年雖對馬蹄皮提取物的抗菌抗氧化活性也有少量研究[1,3,4]，但利用馬蹄皮中黃酮類化合物與其它藥食同源植物中的黃酮類化合物進行協(xié)同活性研究尚未報道。同樣為藥食同源的陳皮富含黃酮類化合物，但是大量的柑橘在被加工成果汁后，其果皮被廢棄不用。為實現(xiàn)廢棄橘皮資源化利用,深入對橘皮中黃酮類化合物進行研究,以提高橘皮的綜合利用價值[5,6]。

本文以乙醇為溶劑，采用超聲輔助提取法分別從馬蹄皮和陳皮中提取總黃酮化合物，利用蘆丁標準曲線明確提取總黃酮濃度。馬蹄皮和陳皮中含有的黃酮亞類不同，復配后的協(xié)同抗氧化抗菌活性的變化具有一定的研究意義[7]。研究馬蹄皮和陳皮中總黃酮不同比例的抗氧化抗菌活性，可以為實現(xiàn)藥食同源的馬蹄皮和陳皮資源化，為有效開發(fā)和利用廢棄果皮，并為馬蹄皮和陳皮在食品和藥品領域的應用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與設備

新鮮馬蹄果產自安徽省蕪湖市無為市；蕓香甙標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH，>97%)標準品、ABTS(>98%)、AB-8大孔樹脂、硫酸亞鐵、鄰羥基苯甲酸、雙氧水、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氨芐青霉素和卡那霉素均從阿拉丁試劑(上海)有限公司購買；其它所用試劑均是分析純。大腸桿菌(ATCC 11303)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、枯草芽孢桿菌(ATCC 2233)、四鏈球菌(ATCC 2835)來自安徽工程大學生物與食品工程學院。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬蹄皮和陳皮總黃酮提取

自水果超市購買新鮮蘆柑，剝去柑皮即為陳皮，干燥備用。取新鮮馬蹄果，剝皮干燥，備用。將干燥的陳皮和馬蹄皮經粉碎機粉碎，過80目篩，得到馬蹄皮粉末和陳皮粉末。取上述粉末各100mg，分別加入300mL85%乙醇溶液，于溫度30℃，超聲功率300W條件下超聲60min，將提取液于10000轉·min-1離心10min，收集上清液。收集沉淀物繼續(xù)上述乙醇超聲提取操作，合并濾液，使用旋轉蒸發(fā)儀將粗提液旋蒸，即為總黃酮粗提液。將上述總黃酮粗提液，通過AB-8大孔樹脂純化收集得到總黃酮溶液，為待測樣液[8]。將陳皮與馬蹄皮總黃酮按照濃度比3∶1、1∶1、1∶3混合(以下濃度比均為陳皮總黃酮∶馬蹄皮總黃酮)。

1.2.2 繪制標準曲線

準確稱取0.5g蕓香甙標準品，用80%乙醇溶解并定容至100mL，得到5.0mg·mL-1蕓香甙標準品母液。分別取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL蘆丁標準溶液于試管中，添加80%乙醇至10mL。分別取上述溶液1mL，分別向各試管中加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，靜置10min后，加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，靜置6min后，加4%氫氧化鈉溶液2mL，加蒸餾水至待測混合液總體積為5.0mL，振蕩混勻后靜置3min，于508nm處測定吸光度值，試驗重復3次取平均值，將吸光度作為縱坐標，濃度(mg·mL-1)作為橫坐標繪制標準曲線。根據標準曲線，分別通過紫外可見分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)測定馬蹄皮和陳皮提取液的總黃酮吸光度，換算出二者提取液中黃酮的濃度。

1.2.3 最小抑菌濃度試驗

大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)、枯草芽孢桿菌、四鏈球菌和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)菌種均使用LB培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)使用LB液體培養(yǎng)基，于37℃過夜培養(yǎng)。將活化培養(yǎng)的菌種再以(1∶40)的比例重新接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37℃，時間為2～3h，當菌液的紫外吸收OD600nm達到0.5，此時細胞處于對數(shù)期。

通過微量稀釋法測定不同質量分數(shù)馬蹄皮總黃酮和陳皮總黃酮水溶液最小抑制濃度值(MICs)，陽性對照藥物為氨芐青霉素和卡那霉素。簡言之，將對數(shù)期大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌細胞接種于含有不同藥液的試管中，并在37℃下溫育12h。MIC值定義為可抑制細菌生長的最低藥物濃度，每組重復3次，取平均值[9]。

1.2.4 抑菌圈試驗

取對數(shù)期的大腸桿菌菌液100μL于固體LB培養(yǎng)基中進行涂布，使用藥敏片中含有質量分數(shù)為10%的馬蹄皮總黃酮、陳皮總黃酮、3∶1(陳皮總黃酮∶馬蹄皮總黃酮)、1∶1(陳皮總黃酮∶馬蹄皮總黃酮)和1∶3(陳皮總黃酮∶馬蹄皮總黃酮)分別放置于含每種細菌的固體培養(yǎng)基中，將不含藥物溶液的PBS組藥敏片設定為空白組，培養(yǎng)24h后測定抑菌圈直徑，試驗重復3次取平均值[10]。

1.2.5 DPPH自由基清除率測定

參考Rodrigo Scherer等的方法，用80%乙醇配制總黃酮濃度分別為1μg·mL-1、2μg·mL-1、4μg·mL-1、8μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的總黃酮溶液(陳皮總黃酮∶馬蹄皮總黃酮=3∶1、1∶1、1∶3)，相同濃度的VC溶液設置成對照組，各取2mL于試管中，加入2mL 0.2mM DPPH溶液，搖勻，室溫下避光反應30min，測定反應樣液在517nm處吸光值記為Ai，以無水乙醇替代DPPH溶液，測定吸光度值記為Aj，以無水乙醇替代樣品溶液，測定吸光度值記為A0，測量3次取平均值，計算DPPH自由基清除率的公式[11]：

DPPH自由基清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

1.2.6 ABTS+·清除率測定

將ABTS溶液(10mL、7mM)和過硫酸鉀溶液(10mL、4.9mM)混合后搖勻，室溫條件下遮光過夜保存，得到ABTS+·儲備液。使用時取儲備液稀釋，于734nm處測定吸光度值，現(xiàn)配現(xiàn)用。參考呂平等的方法，用80%乙醇配制總黃酮濃度分別為5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1總黃酮溶液(陳皮總黃酮∶馬蹄皮總黃酮=3∶1、1∶1、1∶3)，配制相應濃度的VC溶液。取200μL各樣品于試管中，加入4mL ABTS+·溶液，振蕩搖勻，室溫下下避光反應 6 min，于734 nm處測定吸光度值記為Aw，以無水乙醇替代ABTS+·溶液，測定吸光度值記為Ae，以無水乙醇替代樣品溶液，測定吸光度值記為Aq，測量3次取平均值。計算 ABTS+·清除率的公式[12]：

ABTS+·清除率=[Aq-(Aw-Ae)]/Aq×100%

1.2.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS軟件進行方差回歸分析，計算自由基的半清除率濃度IC50值。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

蘆丁作為黃酮類化合物標準品進行蘆丁標準曲線方程為Y=1.9659X，R2=0.9992，結果呈現(xiàn)顯著線性相關。通過檢測陳皮和馬蹄皮提取總黃酮在508nm處吸光度值，并對照標準曲線可知，陳皮總黃酮含量為45.735mg·L-1，馬蹄皮的總黃酮含量為40.58mg·L-1。

2.2 馬蹄皮和陳皮總黃酮的紫外光譜

馬蹄皮、陳皮和蘆丁標準品測得的紫外可見光譜結果如圖2所示，通過標準品結果可知，黃酮類的化合物，其甲醇溶液的特征峰位置為360nm。根據馬蹄皮和陳皮中黃酮提取結果的紫外可見光譜掃描結果可知，二者的特征峰位置均和蘆丁黃酮中的類似，說明從馬蹄皮和陳皮中提取出的化合物確實為黃酮類化合物。

2.3 馬蹄皮和陳皮總黃酮的抑菌活性

黃酮類化合物可作為一種有效的抗菌類藥物，在體外抑菌活性使用中常常呈現(xiàn)出高效的抑菌活性。藥食同源馬蹄和陳皮往往表現(xiàn)出抗菌消炎的功效，主要作用機制是馬蹄皮和陳皮中總黃酮的存在，因此研究馬蹄皮和陳皮抗菌抗氧化活性，首先進行抑菌活性篩選試驗，進行MIC試驗測試。使用馬蹄皮和陳皮中總黃酮進行MIC測試，MIC試驗方法分別對4種常見的細菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、四鏈球菌和金黃色葡萄球菌)進行抑菌活性篩選。結果表明，馬蹄皮和陳皮總黃酮對多種細菌都表現(xiàn)較強的抑菌活性，見表1，說明具有廣譜的抗菌活性。結果表明，馬蹄皮總黃酮對上述4種細菌的MIC值分別為17.33±0.67μg·mL-1、22.0±0.25μg·mL-1、20.0±0.32μg·mL-1和26.67±0.37μg·mL-1；陳皮總黃酮對上述4種細菌的MIC值分別為19.33±0.72μg·mL-1、18.0±0.45μg·mL-1、16.67±0.81μg·mL-1和22.0±0.98μg·mL-1。綜上可知，馬蹄皮和陳皮總黃酮表現(xiàn)廣譜的抗菌活性，對大腸桿菌效果最好，因此進一步使用CFU法驗證馬蹄皮和陳皮總黃酮對大腸桿菌的抗菌活性。

表1 最小抑菌濃度試驗

如圖3所示，馬蹄皮總黃酮、陳皮總黃酮以及二者不同比例的混合物的抑菌圈試驗結果，PBS處理組設置成空白組。圖3A為抑菌圈結果圖，從圖中可知，質量分數(shù)為10%的馬蹄皮總黃酮和陳皮總黃酮都表現(xiàn)出對大腸桿菌的抑制作用，但是效果不明顯，可能原因是總黃酮的濃度較低。通過觀察不同比例的馬蹄皮總黃酮和陳皮總黃酮抑菌圈結果可知，當馬蹄皮總黃酮和陳皮總黃酮為1∶3時，展現(xiàn)的抑菌效果最明顯。由圖3B結果可知，抑菌圈直徑由小到大依次為陳皮總黃酮(9.2mm)<馬蹄皮總黃酮(10.1mm)<3∶1(11.6mm)<1∶1(12.0mm)<1∶3(14.5mm)。綜合圖3結果可知，當馬蹄總黃酮的比例提高后，其組合物的抑菌活性明顯提高，說明馬蹄總黃酮比陳皮總黃酮的抑菌活性高，同時二者之間具有協(xié)同抑菌活性。

2.4 馬蹄皮和陳皮總黃酮的DPPH自由基清除能力評估

DPPH醇溶液與黃酮類化合物作用后，通過溶液顏色的深淺可判斷DPPH的清除功效，不同質量分數(shù)的馬蹄皮總黃酮和陳皮總黃酮和VC對比觀察清除DPPH自由基能力結果如圖4所示。隨著試劑濃度增加，DPPH自由基被清除效率增大。經SPSS分析可知，DPPH自由基半清除濃度由小到大依次為3∶1(IC50=3.83±0.12μg·mL-1)<1∶1(IC50=3.57±0.21μg·mL-1)<1∶3(IC50=3.37±0.15μg·mL-1)<陳皮總黃酮<馬蹄總黃酮1∶3>3∶1。

表2 DPPH自由基半清除濃度的統(tǒng)計學分析結果

2.5 馬蹄皮和陳皮總黃酮的ABTS+·自由基清除能力評估

ABTS+·溶液與黃酮類化合物作用后，通過檢測溶液吸光度大小可判斷ABTS+·的清除功效，不同質量分數(shù)的馬蹄皮總黃酮和陳皮總黃酮和VC對比觀察清除ABTS+·自由基能力結果如圖5所示。隨著樣品濃度增加，ABTS+·自由基清除率增大且逐漸趨于平緩。經SPSS分析可知，ABTS+·自由基半清除濃度由小到大依次為3∶1(IC50=9.60±0.21μg·mL-1)<1∶1(IC50=13.21±0.15μg·mL-1)<1∶3(IC50=14.53±0.12μg·mL-1)<陳皮總黃酮<馬蹄總黃酮1∶3>3∶1。

表3 ABTS+·自由基半清除濃度的統(tǒng)計學分析結果

3 討論

根據研究結果可知，馬蹄皮和陳皮中都含有豐富的黃酮類化合物，陳皮總黃酮含量為45.735mg·L-1，馬蹄皮的總黃酮含量為40.58mg·L-1，陳皮中總黃酮含量略高于馬蹄皮總黃酮。通過CFU試驗結果表明，當馬蹄皮總黃酮和陳皮總黃酮按不同比例混合時，其對大腸桿菌的抑菌活性有明顯提高，說明二者之間的復配均有協(xié)同抑菌活性。同樣類似的協(xié)同活性也體現(xiàn)在抗氧化活性研究中，各組自由基清除率試驗中γ均小于1，且有顯著性差異，表明馬蹄皮和陳皮總黃酮具有協(xié)同抗氧化作用，且不同的復配比對同種自由基的清除效果有差異。本文只進行3種濃度比例的抗菌抗氧化活性研究，數(shù)據量不夠，需要進行大量復配比例以及重復性研究，相關抗菌抗氧化活性內容不夠充分，需要通過在動物水平試驗進一步驗證二者的協(xié)同活性。