王 田，許仕琳，王 濤，溫 濤，孟 潔，劉 健，許海燕

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院 生物醫(yī)學工程學系，北京 100005)

急性T細胞淋巴細胞白血病(acute T lymphocyte leukemia，T-ALL)是一種早期的淋巴樣腫瘤，約占兒童和成人急性淋巴細胞白血病的15%和25%[1]。目前，放射療法、化學療法和造血干細胞移植等傳統(tǒng)治療方法可使80%以上的患者獲得臨床完全緩解，但復發(fā)率高達50%，患者的5年生存率較低[2]。NOTCH1是一種I型膜蛋白受體，也是一種配體激活型轉(zhuǎn)錄因子，與配體結(jié)合后可將胞外信號傳導至胞內(nèi)，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達，對T細胞的自我更新、增殖、分化和凋亡起重要作用[3]。NOTCH1異常激活時可導致細胞過度增殖、周期失控[4]。研究表明，超過65%的T-ALL病例中有NOTCH1信號異常激活，且是T-ALL發(fā)生的主導因素[5]。以慢病毒為載體遞送靶向NOTCH1的siRNA，可在體外顯著抑制T-ALL細胞增殖和促進細胞凋亡。但是使用病毒載體有安全性和免疫原性等方面的風險，而常規(guī)非病毒載體對于T細胞的轉(zhuǎn)染效率很低[6]。因此，發(fā)展更加安全有效的遞送載體具有重要意義。

普魯蘭是一種天然的水溶性多糖[7]。精胺是一種存在于所有真核細胞中的多胺，參與基本的細胞代謝[8]。將精胺共價導入普魯蘭分子所形成的陽離子化多糖-精胺普魯蘭(pullulan-spermine，Ps)已被用于介導神經(jīng)細胞[9]、內(nèi)皮細胞[10]、肝細胞[11]的基因轉(zhuǎn)染，特別是在難轉(zhuǎn)染的慢性髓系白血病細胞[12]中能發(fā)揮較好的轉(zhuǎn)染效果。考慮到siRNA與陽離子化高分子形成的復合物常通過內(nèi)吞途徑而定位于溶酶體，難以進入細胞質(zhì)，本研究將溶酶體促滲劑地氯雷他定(desloratadine，DL)與Ps相結(jié)合，研究兩者聯(lián)合介導的NOTCH1沉默對急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心)；改良型PRMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青霉素及鏈霉素雙抗溶液(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；地氯雷他定(Aladdin公司)；NC siRNA(siNC：5′-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3′)和NOTCH1siRNA(siNOTCH1：5′-CCAACCCUGUCAAUGGCAATT-3′)(上海吉瑪公司)；碘化丙啶染色溶液(PI)(Invitrogen公司)；Annexin V-633凋亡檢測試劑盒(Dojindo Molecular Technologies公司)；RIPA高效細胞裂解液(索萊寶公司)；彩色預染蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific公司)；胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司)；兔源抗C-MYC(Abcam公司)；兔源抗caspase 3、cleaved caspase 3和鼠源抗β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗(北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司)；Western blot化學發(fā)光HRP底物反應(yīng)液(Millipore公司)；DEPC處理水(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA/Ps復合物的制備：Ps的制備方法詳見參考文獻[13]。Ps和siRNA 均用DEPC處理水配制為0.25 g/L的工作液，將5.28、3.20、1.60和1.00 μg siRNA分別與4.00 μg Ps混勻，室溫靜置孵育30 min，以獲得N/P比分別為1.5、2.5、5和7.5的siRNA/Ps復合物。

1.2.2 動態(tài)光散射法檢測：將siRNA/Ps分散在1 mL純水或含10% FBS的培養(yǎng)基中，用Zetasizer Nano ZS90 (Malvern公司)在室溫下檢測復合物的粒徑和Zeta電位。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：Jurkat細胞使用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的改良型RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗分為未轉(zhuǎn)染的對照組、siNC/Ps組、siNC/Ps+DL組、siNOTCH1/Ps組和siNOTCH1/Ps+DL組。12孔板每孔接種1 mL細胞懸液(1×106個細胞)，siNC/Ps或siNOTCH1/Ps轉(zhuǎn)染細胞6 h后換液，加入完全培養(yǎng)基或含10 μmol/L DL的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育至24 h。

1.2.4 實時熒光定量PCR：收集上述各組細胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測：1)換液，在正常培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24 h。按常規(guī)流程處理細胞，用流式細胞儀(Accuri C6，BD公司)檢測細胞周期。2)收集上述各組細胞，用100 μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸細胞，依次加入5 μL Annexin V和5 μL PI室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Western blot：收集上述各組細胞，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為20 μg/孔，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(C-MYC、caspase 3、cleaved caspase 3和β-actin，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。加入ECL化學發(fā)光試劑，在化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon 4800，上海天能科技有限公司)中成像。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同N/P比siRNA/Ps的粒徑和Zeta電位

動態(tài)光散射檢測的結(jié)果(表1)表明，在純水中，當N/P比為1.5、5和7.5時，siRNA/Ps復合物的粒徑相近，均約200 nm；但N/P比為2.5時，復合體粒徑可達992 nm。隨著N/P比的增大，siRNA/Ps的表面電荷由負轉(zhuǎn)正，當N/P≥2.5時，復合物帶正電荷?？紤]到細胞膜帶負電荷，表面正電性的復合物較有利于細胞攝取，同時為了搭載盡可能多的siRNA，后續(xù)選擇N/P比5的siRNA/Ps進行實驗。該復合物在10% FBS中能保持穩(wěn)定分散，但水合粒徑略有增加(圖1)。

表1 不同N/P比的siRNA/Ps的粒徑和Zeta電位

圖1 N/P比為5的siRNA/Ps在純水及10% FBS培養(yǎng)基中的粒徑分布Fig 1 Particle size distribution of siRNA/ Ps with N/P ratio of 5 in water and in 10% FBS medium

2.2 siRNA/ Ps聯(lián)合DL對Jurkat細胞NOTCH1基因表達的干擾效果

結(jié)果顯示(圖2)，與對照組相比，siNC/Ps組和siNC/Ps +DL組細胞未觀察到基因沉默效果；siNOTCH1/Ps組基因沉默效率為28%；當siNOTCH1/Ps與DL聯(lián)合后，NOTCH1沉默效率可提升至67%。這一結(jié)果說明溶酶體促滲劑DL可顯著增強siNOTCH1/Ps介導的NOTCH1沉默效果。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with siNOTCH1/Ps group圖2 實時熒光定量PCR檢測各組細胞中NOTCH1mRNA的相對表達量Fig 2 The relative expression level of NOTCH1 mRNA in each group detected by real-time fluorescent

2.3 干擾NOTCH1基因表達對NOTCH1信號下游蛋白C-MYC表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，與對照組相比，siNOTCH1/Ps+DL組的C-MYC蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，而其余各組則無此效應(yīng)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group圖3 各組細胞中NOTCH1信號下游蛋白C-MYC表達水平的比較Fig 3 Comparison of the expression level of downstream protein C-MYC of NOTCH1 signal in each group n=4)

2.4 干擾NOTCH1基因表達對細胞周期的影響

與對照組相比，siNC/Ps組、 siNC/Ps+DL組及siNOTCH1/Ps組的細胞周期無顯著變化；但當siNOTCH1/Ps與DL聯(lián)合后，細胞周期顯著阻滯在G1期(P<0.05)(圖4)。

A.control；B.siRNA/Ps+DL；C.cell cycle arrest in each group；*P<0.05 compared with control group圖4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的周期變化Fig 4 Cell cycle distribution of each group detected by flow cytometry n=3)

2.5 干擾NOTCH1基因表達對細胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染24 h后，對照組、siNC/Ps組、siNC/Ps+DL組、siNOTCH1/Ps組和siNOTCH1/Ps+DL組的細胞凋亡率分別為5.56%、7.14%、7.38%、9.35%和13.93%。與對照組相比，siNC/Ps和siNC/Ps +DL沒有誘導細胞凋亡；siNOTCH1/Ps組的細胞凋亡率明顯增加，而siNOTCH1/Ps+DL組的細胞凋亡率顯著高于其他各組(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with siNOTCH1/Ps group圖5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡情況Fig 5 Cell apoptosis of each group detected by flow cytometry

2.6 干擾NOTCH1基因表達對caspase 3和cleaved caspase 3蛋白表達水平的影響

轉(zhuǎn)染24 h后，與對照組相比，siNOTCH1/Ps組cleaved caspase 3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，caspase 3蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)；當siNOTCH1/Ps與DL聯(lián)合時，Jurkat 細胞中cleaved caspase 3蛋白的表達水平進一步升高(P<0.05)，caspase 3蛋白的表達水平進一步降低(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with siNOTCH1/Ps group圖6 各組細胞中caspase 3和cleaved caspase 3蛋白表達水平的比較Fig 6 Comparison of caspase 3 and cleaved caspase 3 protein expression levels in each

3 討論

合成高分子與siRNA形成的復合物主要通過內(nèi)吞途徑進入細胞，因此，溶酶體對復合物的捕獲和降解是影響RNA干擾效率的主要障礙?，F(xiàn)有的促進復合物溶酶體逃逸的策略會引起嚴重的溶酶體膜損傷，導致組織蛋白酶的胞內(nèi)釋放，由此觸發(fā)細胞死亡[14-15]。相比之下，低分子質(zhì)量陽離子兩親性藥物(cationic amphiphilic drugs，CADs)DL在刺激癌細胞中siRNA的溶酶體逃逸方面顯示出了巨大潛力。如當葡聚糖凝膠載體轉(zhuǎn)染非小細胞癌細胞時，DL的聯(lián)合使用可誘導短暫的、微小的溶酶體膜通透化，顯著促進大量的siRNA進行溶酶體逃逸，且不影響細胞活性[16]。

本研究利用DL增強siRNA在Jurkat細胞溶酶體中的逃逸效率，獲得了預期的效果，表明溶酶體促滲劑DL可顯著增強RNA介導的NOTCH1沉默效率，抑制NOTCH1信號下游蛋白C-MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達，使細胞發(fā)生G1期周期阻滯。此外，干擾NOTCH1后觀察到了非活化型caspase 3的減少和活化型cleaved caspase 3的同步增加，表明沉默NOTCH1可誘導Jurkat細胞的凋亡。因此，將有溶酶體逃逸作用的DL與靶向NOTCH1信號通路的siNOTCH1/Ps相結(jié)合，有可能為治療T-ALL提供一種新方法。此項研究僅在細胞模型上進行，體內(nèi)效果還有待驗證。

綜上，Ps聯(lián)合DL可有效介導Jurkat細胞NOTCH1的沉默，由此誘導了急性T淋巴細胞白血病細胞G1期周期阻滯，并促進細胞凋亡。