楊 陽，王欣晨，牛云峰，郭 煒，梁 佳，郭艷麗，董稚明

胃賁門腺癌(gastric cardia adenocarcinoma, GCA)屬于胃癌的特殊類型[1]，大部分GCA患者發(fā)現(xiàn)時已為進展期或晚期，易轉(zhuǎn)移和復發(fā)，5年生存率低[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是近年腫瘤領域的研究熱點，大量文獻報道其能夠在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各階段發(fā)揮促癌或抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA FOXD3-AS1在結(jié)直腸癌、肝癌、甲狀腺癌中高表達，發(fā)揮促癌作用，但尚未見其在GCA中的報道。本文著重探討FOXD3-AS1在GCA中的表達及其對腫瘤生物學行為的影響，為GCA的診斷、預后評估和靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年6月～2016年12月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院收治的53例GCA患者的手術(shù)標本，男性47例，女性6例，中位年齡63歲(范圍49～83歲)。一部分手術(shù)切除標本保存于-80 ℃液氮中便于提取RNA，另一部分標本HE染色后經(jīng)病理醫(yī)師診斷均為GCA。本實驗經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和MTS試劑，均購自美國Promega公司；胰蛋白酶、TRIzol、RIPA裂解液、10×電轉(zhuǎn)液、SDS-PAGE電泳液(10×)和5×蛋白上樣緩沖液，均購自北京索萊寶公司。實驗引物購自上海生工生物公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)儀購自美國ABI公司。胃癌細胞系BGC-823、SGC-7901、HGC-27、MGC-803，由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤研究所病理研究室留存并傳代。實驗樣本均來自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生物標本庫。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 收集53例GCA組織，加入TRIzol裂解液后勻漿器充分研磨；胃癌細胞用PBS沖洗，加入TRIzol充分懸浮后移入EP管，根據(jù)試劑盒說明書提取組織及4株細胞(BGC-823、SGC-7901、HGC-27、MGC-803)中的總RNA。siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞72 h后，用PBS沖洗，加入TRIzol充分懸浮后移入EP管，根據(jù)試劑盒說明書提取空白對照組、si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組及si-NC轉(zhuǎn)染組細胞的總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行熒光定量PCR擴增，以β-actin作為表達的內(nèi)參。引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度

1.3.2siRNA轉(zhuǎn)染細胞 根據(jù)上述實驗選取FOXD3-AS1表達量最高的SGC-7901細胞進行后續(xù)實驗，將SGC-7901細胞接種在6孔板(2×105個/孔)中，待細胞長至70%～80%融合時，參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，設置空白對照組、si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組及si-NC轉(zhuǎn)染組。收集SGC-7901細胞并提取總RNA，用于觀察細胞轉(zhuǎn)染siRNA后FOXD3-AS1的表達。

1.3.3MTS實驗和克隆形成實驗 MTS實驗：轉(zhuǎn)染后的SGC-7901細胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，胰酶消化計數(shù)后接種于96孔板(1×103個/孔)，每組6個復孔，待細胞貼壁后分別于0、24、48、72和96 h每孔加入MTS試劑(500 μg/mL)，繼續(xù)37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后用酶標儀檢測每孔的吸光度值。克隆形成實驗：轉(zhuǎn)染后的SGC-7901細胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，胰酶消化計數(shù)后將5×103個細胞均勻接種于6孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1周后取出，固定染色后計算克隆形成率。

1.3.4劃痕愈合實驗和Transwell侵襲實驗 劃痕愈合實驗：轉(zhuǎn)染后的SGC-7901細胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，胰酶消化計數(shù)后將5×105個細胞均勻接種于6孔板中，孵育24 h后，用200 μL槍頭垂直劃痕形成每孔的人工刮擦，換成RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在劃痕后0、12和24 h測量劃痕寬度并計算細胞遷移率。Transwell侵襲實驗，轉(zhuǎn)染后的SGC-7901細胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，胰酶消化計數(shù)后用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞，在小室上室中加入50 μL Matrigel，37 ℃過夜，將1×105個細胞接種至小室上室，小室下室加入含牛血清培養(yǎng)基，37 ℃恒溫孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室將細胞固定后染色20 min，最后進行細胞計數(shù)，比較組間差異。

1.3.5Western blot法 按照蛋白提取試劑盒操作流程，使用含有蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液對細胞進行裂解，提取細胞總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明書進行操作，定量總蛋白的濃度，分別取50 μg蛋白樣本，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，以80 V為起始電壓進行電泳，30 min后以120 V電泳1 h，應用轉(zhuǎn)膜技術(shù)將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加一抗(兔單克隆抗體E-cadherin、N-cadherin、vimentin、β-catenin及β-actin)4 ℃搖床過夜，次日TBST緩沖液沖洗3次，每次10 min；加二抗后室溫孵育1 h，TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。電化學發(fā)光液顯色后拍照，凝膠成像分析儀采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 GCA中FOXD3-AS1表達與臨床病理特征的關系qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3-AS1在GCA組織中的表達量為2.160(0.928，3.406)，高于癌旁正常組織的0.734(0.320，1.836)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.695，P=0.007，圖1)。本組結(jié)果亦顯示，Ⅲ+Ⅳ期GCA組織中FOXD3-AS1的表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GCA組中FOXD3-AS1表達水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)；FOXD3-AS1的表達與患者年齡、性別、分化程度均無相關性(P均>0.05，表2)。

表2 GCA中FOXD3-AS1表達與臨床病理特征的關系

圖1 qRT-PCR法檢測FOXD3-AS1在GCA及正常組織中的表達

2.2 胃癌細胞系FOXD3-AS1的表達與si-FOXD3-AS1敲低的關系隨機選取10例賁門正常黏膜組織的cDNA，按等比例混合后作為正常對照細胞。FOXD3-AS1在4株癌細胞系中的表達：SGC-7901(4.369±0.293)、MGC-803(1.281±0.048)、BGC-823(2.143±0.431)、HGC-27(2.908±0.505)，高于正常對照細胞(1.074±0.160)，差異有統(tǒng)計學意義(F=48.694，P<0.01，圖2)。SGC-7901細胞中FOXD3-AS1表達量最高，選取其構(gòu)建FOXD3-AS1敲低細胞株。qRT-PCR結(jié)果顯示，SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染si-FOXD3-AS1后，F(xiàn)OXD3-AS1的表達量(0.667±0.020)低于si-NC轉(zhuǎn)染組(0.967±0.073)、空白對照組(1.013±0.044)，差異有統(tǒng)計學意義(F=17.425，P=0.003)。

圖2 qRT-PCR法檢測FOXD3-AS1在不同胃癌細胞中的表達

2.3 敲低FOXD3-AS1對SGC-7901細胞增殖能力的影響MTS結(jié)果顯示，從72 h開始si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯低于si-NC轉(zhuǎn)染組及空白對照組，分別為0.702±0.036、1.162±0.074和1.324±0.049，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A)?？瞻讓φ战M與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組細胞克隆形成率(5.053%±0.221%)低于si-NC轉(zhuǎn)染組(8.453%±0.232%)和空白對照組(8.187%±0.280%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B)?？瞻讓φ战M與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示敲低FOXD3-AS1可以抑制細胞的增殖能力。

圖3 A.MTS法檢測FOXD3-AS1對SGC-7901細胞增殖能力的影響；B.克隆形成實驗檢測FOXD3-AS1對SGC-7901細胞增殖能力的影響

2.4 敲低FOXD3-AS1對SGC-7901細胞遷移能力的影響劃痕實驗結(jié)果顯示，si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組細胞的12 h遷移率(4.761%±1.886%)低于si-NC轉(zhuǎn)染組(9.659%±2.339%)和空白對照組(9.564%±3.297%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組細胞的24 h遷移率(6.761%±1.886%)低于si-NC轉(zhuǎn)染組(18.959%±2.339%)和空白對照組(21.264%±3.297%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4)?？瞻讓φ战M與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示敲低FOXD3-AS1后可以抑制SGC-7901細胞體外遷移。

圖4 細胞劃痕實驗檢測FOXD3-AS1對SGC-7901細胞遷移能力的影響

2.5 敲低FOXD3-AS1對SGC-7901細胞侵襲能力的影響Transwell小室實驗結(jié)果顯示，si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組每個視野下穿膜細胞數(shù)(276.200±24.118)低于si-NC轉(zhuǎn)染組(373.6±24.162)和空白對照組(371.8±26.329)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。空白對照組與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示敲低FOXD3-AS1后可以抑制SGC-7901細胞侵襲能力。

圖5 Transwell小室實驗檢測FOXD3-AS1對SGC-7901細胞遷移能力的影響:A.空白對照組;B.si-NC轉(zhuǎn)染組;C.si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組

2.6 敲低FOXD3-AS1對SGC-7901細胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)標志因子mRNA和蛋白表達的影響qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組中E-cadherin mRNA表達量為5.20±0.36，明顯高于空白對照組(1.02±0.08)和si-NC轉(zhuǎn)染組(0.97±0.10)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與si-NC轉(zhuǎn)染組中的E-cadherin mRNA的表達量，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組中N-cadherin、β-catenin和vimentin的mRNA表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與si-NC轉(zhuǎn)染組中的N-cadherin、β-catenin和vimentin的mRNA表達量，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖6A)。Western blot實驗結(jié)果表明，與空白對照組和si-NC轉(zhuǎn)染組相比，si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染組E-cadherin的蛋白表達水平升高，N-cadherin、vimentin和β-catenin的蛋白表達水平下降，與mRNA的表達趨勢一致(圖6B)。

圖6 A.qRT-PCR法檢測FOXD3-AS1對EMT相關分子mRNA表達的影響；B.Western blot法檢測FOXD3-AS1對EMT相關分子蛋白表達的影響

3 討論

胃癌位居消化道惡性腫瘤之首，每年有大量的新發(fā)和死亡病例。臨床數(shù)據(jù)顯示，早期胃癌患者5年生存率超過90%，中晚期胃癌患者即便經(jīng)過綜合治療，5年生存率仍低于30%[3]。LncRNA本身不編碼蛋白或只編碼較小的多肽，因缺少完整的開放閱讀框，這些非編碼轉(zhuǎn)錄本曾被認為是“轉(zhuǎn)錄噪音”。最新研究表明，LncRNA在乳腺癌[4]、結(jié)直腸癌[5]、乳腺癌[6]、胃癌[7]及卵巢癌[8]等腫瘤中的表達均有異常，參與腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄、增殖和血管侵襲等過程，提示其可以作為腫瘤的預測因子。

LncRNA FOXD3-AS1由4個外顯子組成，位于FOXD3啟動子上游染色體1p31.3處[9]。Chip-seq數(shù)據(jù)分析顯示，F(xiàn)OXD3-AS1與FOXD3共享啟動子區(qū)域，提示FOXD3-AS1屬于LncRNA中的啟動子上游轉(zhuǎn)錄本[10]。研究表明，F(xiàn)OXD3與黑色素瘤[11]、肺癌[12]及結(jié)直腸癌[13]抑制相關。最新文獻報道表明，F(xiàn)OXD3-AS1直接作用于miR-127-3p/ MDM2軸促進非小細胞肺癌的化學耐藥性[14]。FOXD3-AS1在黑色素瘤細胞中明顯上調(diào)，通過調(diào)節(jié)miR-127-3p/ FJX1軸促進黑色素瘤的進展[15]。Liu等[16]報道FOXD3-AS1在肝癌中高表達，且FOXD3-AS1水平高的肝細胞癌患者預后較差。此外，F(xiàn)OXD3-AS1的敲除可以與miR-335競爭性結(jié)合抑制RICTOR表達，從而通過AKT信號通路的失活抑制肝癌細胞的生長。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)抑制LncRNA FOXD3-AS1可使miR-296-5p表達水平升高，同時使TGF-β1/ Smads信號通路失活，抑制甲狀腺癌的侵襲性生物學行為。Wu等[18]發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1在結(jié)直腸癌中表達增加，對結(jié)直腸癌的發(fā)展有促進作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3-AS1在GCA組織和胃癌細胞系中呈高表達，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關。進一步構(gòu)建si-FOXD3-AS1轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞系，應用MTS法、克隆形成實驗、Transwell小室侵襲實驗及劃痕實驗，驗證FOXD3-AS1與SGC-7901細胞生物學特征的相關性。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)OXD3-AS1敲低會抑制SGC-7901細胞系的增殖、遷移和侵襲能力。

EMT是指在特定條件下，極性上皮細胞向間充質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，獲得侵襲和遷移能力的過程，該過程中E-cadherin表達量降低，而vimentin、β-catenin、N-cadherin表達增加。研究表明，某些LncRNA可以通過影響EMT進程，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。Fu等[19]發(fā)現(xiàn)LINC00978在胃癌中的表達增加，抑制其表達的同時也抑制了胃癌細胞的EMT進程，LINC00978可以通過加速EMT進程，在胃癌中扮演癌基因的角色。LncRNA DANCR在胃癌組織和細胞中表達上調(diào)，轉(zhuǎn)染si-DANCR后，胃癌細胞系BGC823和SGC7901的生長明顯受到抑制，而過表達DANCR可以促進胃癌細胞增殖；基因敲低后，LncRNA DANCR可以通過抑制EMT進而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力，但過表達則有相反的效果[20]。Fan等[21]發(fā)現(xiàn)與正常胃上皮細胞和癌旁細胞相比，LINC00261在胃癌中的表達明顯下調(diào)，其過表達可以通過上調(diào)E-cadherin表達，下調(diào)N-cadherin、vimentin表達抑制EMT進程，從而發(fā)揮在胃癌細胞中的腫瘤抑制作用。目前，尚未有FOXD3-AS1對胃癌細胞EMT進程作用的報道。本組實驗檢測敲低FOXD3-AS1后EMT相關分子表達水平的改變，結(jié)果顯示上皮標志物E-cadherin表達明顯升高，而間質(zhì)標志物N-cadherin、β-catenin及vimentin表達明顯降低，提示FOXD3-AS1可以通過EMT調(diào)節(jié)胃癌細胞的遷移能力。

綜上所述，F(xiàn)OXD3-AS1在GCA中呈高表達，敲低FOXD3-AS1可以抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力。FOXD3-AS1可能通過調(diào)節(jié)相應micRNA在癌癥中起調(diào)控作用，本課題組將進行后續(xù)實驗分析FOXD3-AS1在GCA中高表達的機制，為臨床治療GCA提供新思路。