黃淅睿，楊承綱

乳腺癌是嚴(yán)重威脅我國女性生命健康的惡性腫瘤，而三陰型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中極具侵襲性的一種亞型，占乳腺癌的10%～20%[1]。其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，由于具有高度侵襲性和較低的治療反應(yīng)，預(yù)后比其他乳腺癌亞型更差[2-3]。隨著免疫治療的不斷進展，越來越多的腫瘤患者從中獲益。研究表明，在許多癌癥類型中程序性死亡-配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的表達與更差的預(yù)后相關(guān)，表明PD-L1的分泌促進腫瘤逃避免疫系統(tǒng)[4]。目前PD-L1抑制劑(Atezolizumab)用于TNBC治療的臨床研究，評估PD-L1的表達在臨床實踐中的療效預(yù)測價值日益凸顯[5]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤惡性表型轉(zhuǎn)化的啟動過程，E-cadherin表達的缺失被認(rèn)為是乳腺癌EMT發(fā)生的關(guān)鍵步驟，vimentin與細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)，是EMT的晚期事件[6]。本文著重探討TNBC中PD-L1和EMT標(biāo)志蛋白分子的關(guān)系及其臨床意義，為PD-L1用于TNBC的免疫治療及預(yù)后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2020年6月云南省腫瘤醫(yī)院病理科存檔的125例TNBC組織和50例癌旁組織，125例TNBC患者均為女性，年齡26～82歲，中位年齡50歲，>50歲者58例，≤50歲者67例，已絕經(jīng)者61例，未絕經(jīng)者64例，腫瘤直徑≤2 cm者26例，>2 cm者99例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者57例，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者5例。病理組織學(xué)WHO分級Ⅰ級4例，Ⅱ級59例，Ⅲ級62例；CK5/6陽性者72例，陰性者53例；Ki-67增殖指數(shù)≤14%者17例，>14%者108例；TNBC患者按第8版AJCC乳腺癌分期系統(tǒng)分期，Ⅰ+Ⅱ期者99例，Ⅲ+Ⅳ期者26例。125例患者均有完整臨床資料，病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌，其中119例行手術(shù)切除，術(shù)前均未接受放、化療、靶向治療等。

1.2 試劑PD-L1(SP142)兔單克隆抗體購自Abcam公司，E-cadherin、vimentin兔抗人多克隆抗體均購自福州邁新公司，免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司，PD-L1檢測所需擴增增強二抗(Optiveiw)購自Roche公司。

1.3 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm厚。PD-L1抗體為濃縮液，按1 ∶100比例稀釋，使用Ventana自動免疫組化染色平臺，選擇扁桃體組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。E-cadherin、vimentin采用免疫組化色EnVision兩步法染色，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.4 結(jié)果判讀

1.4.1PD-L1判讀標(biāo)準(zhǔn) 在HE切片中評估腫瘤區(qū)域，納入PD-L1評估范圍的區(qū)域包括浸潤性癌組織腫瘤內(nèi)和瘤周間質(zhì)中的免疫細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞等(圖1)，導(dǎo)管原位癌及腫瘤壞死區(qū)域不納入評分范圍。采用免疫細(xì)胞IC評分計算法：任何強度PD-L1染色的免疫細(xì)胞所占區(qū)域/腫瘤區(qū)域×100%。評分結(jié)果<1%為IC0，≥1%且<5%為IC1，≥5%且<10%為IC2，≥10%為IC3。免疫細(xì)胞染色區(qū)域占腫瘤區(qū)域≥1%(IC1、IC2、IC3)表示PD-L1陽性。此評分標(biāo)準(zhǔn)來源于IMpassion130研究設(shè)計，為FDA批準(zhǔn)的首個采用免疫細(xì)胞評分計算PD-L1評分方法[7]。

圖1 TNBC浸潤性癌組織及分布在瘤內(nèi)間質(zhì)及瘤周間質(zhì)中的淋巴細(xì)胞 圖2 TNBC腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞中PD-L1呈陽性，Ventana法 圖3 TNBC中E-cadherin呈陽性，EnVision兩步法 圖4 TNBC中vimentin呈陽性，EnVision兩步法

1.4.2E-cadherin、vimentin判讀標(biāo)準(zhǔn) E-cadherin陽性細(xì)胞定位于細(xì)胞膜上含有黃色或暗褐色顆粒，vimentin陽性定位于細(xì)胞質(zhì)。高倍鏡下隨機選取10個視野，按陽性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進行結(jié)果判定。(1)按陽性細(xì)胞著色評分：不著色為0分，弱著色或淡黃色為1分，中等著色或棕黃色為2分，強著色或棕褐色為 3 分。(2)按陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞<25%為1分，25%～50%為2 分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分相加：0～4分為陰性，>4分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料兩組間行t檢驗，計數(shù)資料行χ2檢驗，采用Pearson列聯(lián)系數(shù)對PD-L1表達與 EMT 標(biāo)志蛋白的免疫組化結(jié)果行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC中PD-L1的表達PD-L1在正常乳腺組織中不表達，本組125例TNBC中，PD-L1在腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞中表達IC0 67例，IC1 27例，IC2 12例，IC3 19例，PD-L1在TNBC中的陽性率為46.40%(58/125)(圖2)。

2.2 TNBC、癌旁組織中E-cadherin、vimentin的表達TNBC中E-cadherin呈陽性(圖3)，陽性率為52.80%(66/125)；癌旁組織中E-cadherin呈陽性，陽性率為90.00%(45/50)；TNBC組織中的E-cadherin陽性率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.306，P<0.01)。TNBC組織中vimentin呈陽性(圖4)，陽性率為41.60%(52/125)；癌旁組織中vimentin呈陽性，陽性率為16.00%(8/50)；TNBC組織中的陽性率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.388，P=0.001，表1)。

表1 TNBC、癌旁組織中E-cadherin、vimentin的表達 [n(%)]

2.3 TNBC中PD-L1與 E-cadherin、vimentin表達的相關(guān)性本組結(jié)果顯示，TNBC中PD-L1與E-cadherin蛋白呈負(fù)相關(guān)(χ2=17.440，P<0.01)；PD-L1與vimentin蛋白表達呈正相關(guān)(χ2=6.253，P=0. 012，表2)。

表2 TNBC中PD-L1與E-cadherin、vimentin表達的相關(guān)性

2.4 TNBC中PD-L1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關(guān)系本組結(jié)果顯示：PD-L1、E-cadherin、vimentin的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)、組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期均無關(guān)(P>0.05，表3)。本組依據(jù)TNBC中CK5/6表達分為基底細(xì)胞亞型及非基底細(xì)胞亞型，PD-L1在兩者中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 TNBC中PD-L1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

PD-L1是程序性死亡因子-1(programmed cell death-1, PD-1)的配體之一，在多種腫瘤中表達，PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面的受體PD-1結(jié)合，可抑制T細(xì)胞遷移、增殖及分泌細(xì)胞毒性介質(zhì)，從而阻斷抗腫瘤免疫應(yīng)答[8]，PD-L1在TNBC患者中過表達，盡管其機制尚不清楚，但已被認(rèn)為與更強的侵襲力和較差的預(yù)后有關(guān)[9-10]。靶向PD-1/PD-L1途徑可能阻止抑制性T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并重新激活T細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤殺傷功能，從而增強抗腫瘤免疫效應(yīng)[11]。隨著免疫治療研究的不斷推進，目前全球已有5種PD-1/PD-L1抑制劑獲批上市。近年研究發(fā)現(xiàn)，針對PD-L1的單克隆抗體Atezolizumab安全、可耐受，在TNBC中顯示持續(xù)的抗腫瘤效果[12-13]。因此，PD-L1(SP142)作為Atezolizumab的伴隨診斷，檢測其在TNBC中的表達對臨床治療的意義日益顯著。本組PD-L1在TNBC中的陽性率為46.4%(88/125)，PD-L1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)、組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05)，可證實TNBC中PD-L1參與免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫效應(yīng)。本組結(jié)果顯示PD-L1與TNBC臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)，與PD-L1的表達促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移的結(jié)論相悖，可能與本組Ⅲ、Ⅳ期TNBC病例量較少有關(guān)：(1)當(dāng)代女性的健康意識廣泛提高，體檢意識增強，腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早治療得到了更好的實施；(2)隨著新輔助化療的廣泛應(yīng)用，越來越多的晚期乳腺癌患者術(shù)前接受新輔助化療縮小腫瘤、延緩腫瘤進展，從而獲得手術(shù)機會。

EMT是腫瘤細(xì)胞突破基膜獲得侵襲及轉(zhuǎn)移能力的第一步。EMT過程對腫瘤細(xì)胞骨架排列變化起促進作用[14]，使細(xì)胞的黏附功能降低，原發(fā)病灶中的細(xì)胞更容易脫離，從而侵襲或轉(zhuǎn)移到周圍或遠(yuǎn)處組織[15]。E-cadherin是典型的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，對維持細(xì)胞間黏附和個體上皮的完整起關(guān)鍵作用，與腫瘤的浸潤、侵襲能力呈負(fù)相關(guān)[16]。vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，可維持間質(zhì)細(xì)胞特性，與細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時，E-cadherin表達減少，角蛋白為主的細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)變?yōu)関imentin為主的細(xì)胞骨架，從而引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化[17-18]，使腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞間的連接，并更具侵襲性，因此部分TNBC細(xì)胞因發(fā)生EMT呈間質(zhì)表型[19]。本組癌組織中E-cadherin的陽性率明顯低于癌旁組織，而vimentin的陽性率顯著高于癌旁組織，且E-cadherin和vimentin的表達均與與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)、組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05)，與以往研究報道中隨著腫瘤的發(fā)展呈E-cadherin表達降低，而vimentin表達增高的結(jié)果相符。實驗顯示TNBC中E-cadherin和vimentin的表達與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期無關(guān)，與文獻報道有差異，可能與本組晚期TNBC病例數(shù)少有關(guān)。

已有研究表明，在多種腫瘤中PD-L1的表達水平與EMT呈正相關(guān)。Asgarova等[20]證實在肺癌中EMT被TNF-α/TGF-β1誘導(dǎo)，并伴隨PD-L1的表達水平增加，提示可以通過DNA甲基化和NF-κB信號同時控制PD-L1的表達。Alsuliman等[21]的實驗中，使用EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT，促進癌細(xì)胞逃避CD8+毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞裂解過程，支持EMT在乳腺癌細(xì)胞免疫逃逸中的作用，且證明EMT誘導(dǎo)的PD-L1上調(diào)是依賴PI3K/AKT和ERK/MEK途徑，表明EMT狀態(tài)是乳腺癌細(xì)胞PD-L1表達的重要調(diào)節(jié)因子。部分學(xué)者提出EMT還通過腫瘤逃避免疫監(jiān)視的機制促進癌癥進展[22]，間充質(zhì)細(xì)胞被證明能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在體外和體內(nèi)通過TSP1的產(chǎn)生損害樹突狀細(xì)胞，并逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的裂解；免疫組化標(biāo)記如CD8+T細(xì)胞可以刺激乳腺癌細(xì)胞進行EMT[23]。當(dāng)前各項研究表明PD-L1的表達及EMT均可促進腫瘤細(xì)胞的浸潤和遷移，并且靶向PD-1/PD-L1途徑將逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中的EMT[24]。本實驗可見TNBC中PD-L1與E-cadherin蛋白呈負(fù)相關(guān)，與vimentin表達呈正相關(guān)，可初步證實PD-L1的表達在發(fā)生EMT時上調(diào)，與文獻報道相符。EMT通過改變腫瘤細(xì)胞的表型進而增加侵襲能力，由此猜測在EMT過程中各種調(diào)控因子可通過促進PD-L1 的表達，促進腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

綜上所述，PD-L1在TNBC中呈異常高表達，與癌細(xì)胞EMT表型有關(guān)，其具體調(diào)控機制還有待更深入的分析。目前TNBC治療手段較局限，雖然對化療敏感，但短期內(nèi)易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此尋找TNBC有效的治療手段具有重要臨床意義。靶向PD1/PD-L1途徑將可能成為更精準(zhǔn)抗擊腫瘤的策略，2019年Atezolizumab經(jīng)批準(zhǔn)可聯(lián)合化療用于無法切除的局部晚期或轉(zhuǎn)移性TNBC患者，因此檢測TNBC中PD-L1的表達有益于為免疫治療的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，且聯(lián)合評估TNBC中的PD-L1表達水平與EMT狀態(tài)可為探索腫瘤發(fā)展過程及判斷腫瘤的預(yù)后提供依據(jù)。