何春梅，寧詩雨，莫之婧

肝癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，全球肝癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的腫瘤類型[2]，RNA結合蛋白PNO1是已知的核糖體組裝因子，在核糖體生物合成中至關重要。近年越來越多證據(jù)表明，PNO1通過調控p53、Notch和AKT/mTOR信號通路，促進多種腫瘤的進展[3-5]。文獻報道[3-4,6-7]PNO1表達上調，與結直腸癌、肺腺癌和膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展以及遷移、侵襲密切相關。目前，PNO1在HCC中的作用報道較少。本文著重探討PNO1 mRNA在HCC中的表達及與臨床病理特征的關系，以期對其致病機制、臨床意義、預后等提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2010年12月～2012年12月桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院行手術切除的66例HCC組織和21例配對的癌旁組織。66例HCC中，男性57例，女性9例。年齡>50歲者45例，年齡≤50歲者21例。肝硬化患者42例，無肝硬化患者24例。單個瘤體者46例，2個及以上瘤體者20例。多個瘤體者取直徑總和，>5 cm者24例，≤5 cm者42例。低分化者20例，中+高分化者46例。腫瘤包膜完整者47例，包膜缺失者19例。采用美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)第八版進行TNM分期，其中Ⅰ+Ⅱ期56例，Ⅲ+Ⅳ期10例。隨訪時間截至2016年4月。

1.2 主要試劑及儀器CFX96 Real-Time System QPCR儀(美國Bio-RAD)；PCR儀(美國Bio-RAD)；OMEGA RNA提取試劑盒；TAKARA逆轉錄試劑盒；TAKARA實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)試劑盒。PNO1引物由華大基因合成，上游引物：5′-GCGCCAATGGCGAGATCTG-3′，下游引物：5′-GGTGGATCAGCAGGCACTTG-3′；β-actin為內參，上游引物：5′-GAAGAGCTACGAGCTGCCT GA-3′，下游引物：5′-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3′；內參GAPDH引物購自華大基因。

1.3 RNA提取和qRT-PCR檢測細胞系總RNA提取使用OMEGA RNA提取試劑盒，按照RT-PCR試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。PNO1基因qRT-PCR上游引物：5′-GCGCCAATGGCGAGATCTG-3′，下游引物：5′-GGTGGATCAGCAGGCACTTG-3′；β-actin為內參，上游引物：5′-GAAGAGCTACGAGCTGC CTGA-3′，下游引物：5′-CAGACAGCACTGTGTT GGCG-3′。反應條件如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，合計40個循環(huán)，擴增后進行溶解曲線分析，每個樣品均設3個復孔。反應體系為20 μL，其中2 μL cDNA，0.8 μL引物，10 μL SYBR Premix和0.4 μL ROX，加超純水至20 μL。采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)來源從Oncomine數(shù)據(jù)庫中選擇數(shù)據(jù)集Roessler Liver 2中445例標本、Roessler Liver中43例標本和Chen Liver中183例標本、Wurmbach Liver中180例標本和相關臨床病理資料。從UCSC Xena獲得HCC患者經(jīng)log2(x+1)轉換的TCGA RNA-seq數(shù)據(jù)中373例標本。

1.5 基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)實驗基于MSigDB的HCC預后相關基因集對PNO1進行GSEA，以識別PNO1相關的信號通路，使用GSEA v4.0.3軟件進行。TCGA中373例HCC樣本根據(jù)PNO1 mRNA表達水平分為低表達組和高表達組，MSigDB的HCC預后相關基因集作為參考基因集，其他參數(shù)均基于默認值設置。

1.6 統(tǒng)計學分析采用IBM SPSS Statistics Version 20.0和GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析。通過t檢驗比較HCC和癌旁正常組織中PNO1 mRNA的表達。應用Kaplan-Meier法進行生存分析，并通過對數(shù)秩檢驗評估生存曲線的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC及癌旁正常組織中PNO1 mRNA的表達分析Oncomine數(shù)據(jù)庫中3個數(shù)據(jù)集中PNO1 mRNA的表達。Roessler Liver 2數(shù)據(jù)集中，與220例癌旁正常組織相比，PNO1 mRNA在225例HCC組織中表達顯著升高(P<0.001，圖1A)。Roessler Liver數(shù)據(jù)集中，與21例癌旁正常組織相比，PNO1 mRNA在22例HCC組織中表達顯著升高(P<0.001，圖1B)。Chen Liver數(shù)據(jù)集中，與76例癌旁正常組織相比，PNO1 mRNA在104例HCC組織中表達顯著升高(P=0.009，圖1C)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中正常肝組織和HCC組織中PNO1 mRNA的表達：A.PNO1 mRNA在Rossler Liver 2數(shù)據(jù)集中的表達；B.PNO1 mRNA在Rossler Liver數(shù)據(jù)集中的表達；C.PNO1 mRNA在Chen Liver數(shù)據(jù)集中的表達；·代表極端值

qRT-PCR檢測本組21例HCC及癌旁正常組織中PNO1 mRNA的表達。HCC中PNO1 mRNA的相對表達量顯著高于癌旁正常組織(P=0.020 2，圖2)。

圖2 qRT-PCR檢測HCC組織及配對的癌旁正常組織中PNO1 mRNA的表達

2.2 HCC中PNO1 mRNA表達與臨床病理特征的關系Chen Liver數(shù)據(jù)集顯示：與39例無肝炎病毒感染的HCC患者相比，PNO1 mRNA在144例肝炎病毒感染HCC樣本中的表達顯著升高(P=0.002)；Wurmbach Liver數(shù)據(jù)集顯示：PNO1 mRNA在衛(wèi)星結節(jié)(主瘤周邊肝組織內出現(xiàn)肉眼可見或顯微鏡下小癌灶，主要源于微血管侵犯的肝內轉移)或伴血管浸潤HCC中的表達高于無衛(wèi)星結節(jié)或血管浸潤者(P=0.003)。PNO1 mRNA表達與肝炎病毒感染、衛(wèi)星結節(jié)和血管浸潤有關(表1)。

表1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中PNO1 mRNA表達與肝炎病毒感染、衛(wèi)星結節(jié)、血管侵襲的關系

qRT-PCR檢測本組66例HCC組織中PNO1 mRNA表達，并分析其表達與HCC臨床病理特征的關系。HCC組織中PNO1 mRNA表達與腫瘤直徑(P=0.041)和TNM分期(P=0.039)有關；與患者性別、年齡、肝硬化、瘤體個數(shù)、分化程度及腫瘤包膜無關(P>0.05，表2)。

表2 HCC中PNO1 mRNA表達與臨床病理特征的關系

2.3 HCC中PNO1 mRNA表達與預后的關系TCGA數(shù)據(jù)庫顯示：373例HCC患者中有11例失訪，其中181例PNO1 mRNA高表達HCC患者比181例PNO1 mRNA低表達的患者總生存率低(P=0.024)，PNO1 mRNA高表達是HCC患者的風險因子(HR=1.5，圖3)。

圖3 TCGA中PNO1 mRNA表達與HCC患者總生存率的關系

本組66例HCC患者中PNO1 mRNA表達與患者總生存率的相關性。33例PNO1 mRNA高表達HCC患者比33例低表達患者總生存率低(P=0.033 6，圖4)

圖4 66例HCC患者中PNO1 mRNA表達與總生存率的關系

2.4 HCC中PNO1基因相關的信號通路從MSigDB中挑選11個與HCC預后相關的基因集，應用GSEA分析PNO1 mRNA表達水平和HCC預后相關基因集的相關性。LEE_LIVER_CANCER_SURVIVAL_DN和LIAO_METASTASIS 2個基因集在PNO1 mRNA高表達表型中富集，LEE_LIVER_CANCER_SURVIVAL_DN基因集包含的是在預后差的HCC患者中高表達的基因；LIAO_METASTASIS基因集包含的是在肝內轉移性HCC患者中表達上調的基因。表明PNO1 mRNA高表達與HCC患者生存率低及轉移率高相關(圖5)。

圖5 GSEA信號通路富集分析：A.PNO1 mRNA表達在HCC預后相關基因集中的GSEA富集分析；B.PNO1 mRNA表達在HCC肝內轉移相關基因集中的GSEA富集分析

3 討論

HCC起病隱匿，手術及放、化療效果有限，預后差[8]，其發(fā)生、發(fā)展受多種因素的影響。PNO1是內切酶NOB1的相互作用伙伴，介導20S rRNA裂解為成熟的18S rRNA[9]，在核糖體的生物發(fā)生過程中起重要作用。研究表明，RIO1-NOB1-PNO1網(wǎng)絡建立了一個檢查點，防止不成熟核糖體釋放到翻譯池中造成保真度缺陷和擾亂蛋白穩(wěn)態(tài)[10]。細胞中蛋白質的合成場所是核糖體，腫瘤細胞需要有大量的核糖體，才能保持旺盛增殖代謝能力來維持腫瘤細胞的生理活動[11]。文獻報道[12]核糖體的過度激活是多種惡性腫瘤的驅動因素，一些致癌轉錄因子已被證明可以協(xié)調整個核糖體生物發(fā)生，促進腫瘤進展的異常翻譯過程，如C-MYC癌基因通過激活核糖體裝配因子和rRNA的合成加劇核糖體的生物發(fā)生，促進多種腫瘤的進展[13-14]。最近研究表明，抑制核糖體生物發(fā)生的藥物可能為腫瘤治療提供可行的治療方法[15]。

本實驗分析Oncomine數(shù)據(jù)庫中3個數(shù)據(jù)集中PNO1 mRNA的表達，結果顯示PNO1 mRNA在HCC中的表達高于癌旁正常組織。qRT-PCR檢測結果顯示HCC組織中PNO1 mRNA的相對表達量高于癌旁正常組織，與Oncomine數(shù)據(jù)庫中的分析結果相符。PNO1是核糖體新生調控因子，其高表達可能加劇核糖體的合成，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Shen等[3]報道PNO1在結直腸癌組織中表達上調，其高表達與結直腸患者預后差密切相關；PNO1的下調是通過上調p53及其下游p21的表達，抑制細胞增殖和凋亡，從而抑制結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Dai等[5]通過體內外實驗發(fā)現(xiàn)，PNO1可以調節(jié)腫瘤生長的AKT/mTOR信號通路，抑制腫瘤的增殖和轉移。Liu等[4]在體內、體外實驗表明，PNO1表達在肺腺癌組織樣本中上調，其通過Notch信號通路促進肺腺癌細胞的增殖和轉移。

目前，PNO1在HCC中的相關報道較少。Dai等[5]首次報道PNO1在HCC中的致癌作用，但其在HCC中的表達及與臨床病理特征的關系尚未見報道。本組采用qRT-PCR實驗檢測66例HCC組織中PNO1 mRNA表達，相關臨床資料分析表明HCC組織中PNO1 mRNA高表達患者的腫瘤直徑更大、TNM分期更高。有研究表明，伴微血管侵襲的HCC患者腫瘤體積較大[16]。Oncomine數(shù)據(jù)庫分析表明PNO1 mRNA在HCC中表達上調，伴肝炎病毒感染、衛(wèi)星結節(jié)及血管侵襲者PNO1 mRNA表達升高，提示PNO1在HCC的進程中發(fā)揮重要作用，PNO1可能是評估HCC復發(fā)風險和選擇治療方案的重要生物標志物。TCGA數(shù)據(jù)庫顯示：PNO1 mRNA高表達HCC患者的總生存率降低。本組66例HCC患者的預后與TCGA數(shù)據(jù)庫分析相符，提示PNO1可能是引發(fā)HCC預后不良的潛在基因。本組通過GSEA對PNO1進行通路富集分析，結果顯示PNO1 mRNA高表達與HCC患者生存率低及轉移率高相關。Dai等[5]通過體內、外實驗發(fā)現(xiàn)，PNO1對腫瘤的生存和轉移有促進作用，與本實驗結果一致。

綜上所述，PNO1 mRNA表達與HCC發(fā)生轉移、預后不良有關，其是評估HCC復發(fā)風險和選擇治療方案的重要生物學標志物。本組將在后續(xù)實驗對PNO1的生物學功能及其作用機制進一步深入分析，其有望成為HCC治療的新靶標。