李偉，陶云珍，王運(yùn)中，徐俊，魏佳，季健(通信作者)

蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 (江蘇蘇州 215025)

大腸埃希菌是兒童感染性疾病常見(jiàn)的病原菌，可定植在腸道，也可引起呼吸道感染、尿道感染、血流感染等腸外感染[1]。近年來(lái)，隨著免疫抑制劑使用和侵入性治療措施的開展，兒童大腸埃希菌血流感染所致的膿毒癥發(fā)病率明顯增高，同時(shí)其可侵入腦脊液，導(dǎo)致腦膜炎或腦膜腦炎[2]。大腸埃希菌毒力強(qiáng)，所致的膿毒癥、腦膜炎或腦膜腦炎等侵襲性感染是兒童尤其是新生兒重要感染性疾病，可造成患兒各系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害，甚至危及生命[3]。此外，隨著抗菌藥物的廣泛使用，大腸埃希菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[4]。基于此，本研究探討蘇州地區(qū)兒童血液和腦脊液等侵襲性感染大腸埃希菌的分布與耐藥情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

以蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2018年1月至2019年12月患兒血液、腦脊液等穿刺獲得的體液標(biāo)本中檢出的大腸埃希菌作為研究對(duì)象(剔除同一患兒重復(fù)菌株)，所有菌株均采用全自動(dòng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS，BRUKER)鑒定。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌基因組提取

采用煮沸-冷凍法快速提取大腸埃希菌基因組DNA[5]；采用接種環(huán)挑取一環(huán)大腸埃希菌菌落，將其置于含有1 ml無(wú)菌水的EP管中，振蕩混勻，然后將EP管置于100 ℃金屬浴中30 min，取出后放入-20 ℃冰箱冷凍30 min，之后室溫完全解凍，然后以10 000 rpm離心2 min，取上清液加入新的EP試管中，采用紫外分光光度法測(cè)定其濃度和純度后將其置于-20 ℃冰箱作為模板保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2藥敏試驗(yàn)

采用全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀(VITEK 2 compact system，bioMérieux)和紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的大腸埃希菌進(jìn)行藥敏分析，結(jié)果參照美國(guó)國(guó)家和臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)最新標(biāo)準(zhǔn)判讀[7]。

1.2.3β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因檢測(cè)

采用文獻(xiàn)中報(bào)道的碳青霉烯酶基因(NDM-1、OXA-1、VIM-1、KPC-2、IMP-4、AIM-1、GIM-1、SIM-1、SPM-1、BIC-1、DIM-1)[8]、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)基因(TEM-1、CTX-M-14、SHV-1、VEB-1、PER-1)[9]和AmpC酶基因(ACT-1、FOX-1、CIT-1、CMY-2、DHA-1、ACC-1、MOX-1、EBC-1)引物序列[10]，其均委托北京擎科生物科技有限公司上海分公司合成；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)大腸埃希菌中各基因攜帶情況，PCR反應(yīng)總體積25 μl︰ddH2O 9.5 μl，上下游引物(10 μΜ)各1 μl，DNA模板1 μl，2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)12.5 μl，擴(kuò)增條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 10 min；采用2%瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其均委托北京擎科生物科技有限公司上海分公司測(cè)序并進(jìn)行比對(duì)。

1.3 質(zhì)量控制

采用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用WHONET 5.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床分布

本研究涉及67例患兒，其中男44例(65.67%)，女23例(34.33%)，男女比例約為1.91∶1；年齡<1個(gè)月30例(44.78%)，1～12個(gè)月21例(31.34%)，1～18歲16例(23.88%)；共分離到67株侵襲性大腸埃希菌，其中血液標(biāo)本中59株(88.06%)，腦脊液標(biāo)本中8株(11.94%)，主要分布在新生兒科、血液科、重癥監(jiān)護(hù)室等科室，見(jiàn)表1。

表1 兒童侵襲性大腸埃希菌的科室分布情況(67株)

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，67株侵襲性大腸埃希菌對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南和丁胺卡那霉素均不耐藥，對(duì)氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、慶大霉素、妥布霉素、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率也較低，見(jiàn)表2；同時(shí)，產(chǎn)ESBLs的侵襲性大腸埃希菌有25株，產(chǎn)酶率為37.31%。

表2 兒童侵襲性大腸埃希菌的耐藥情況

2.3 耐藥基因攜帶情況

PCR結(jié)果顯示，67株侵襲性大腸埃希菌中檢出的碳青霉烯酶基因?yàn)镹DM-1和OXA-1，ESBLs基因?yàn)門EM-1和CTX-M-14，AmpC酶基因?yàn)锳CT-1、FOX-1、CIT-1、CMY-2和DHA-1，其余碳青霉烯酶基因、ESBLs基因和AmpC酶基因均未檢出，見(jiàn)表3。

表3 兒童侵襲性大腸埃希菌的耐藥基因分布情況(67株)

3 討論

大腸埃希菌是院內(nèi)感染重要病原菌，也是兒童感染性疾病主要病原菌[11]。有資料顯示，大腸埃希菌在醫(yī)院感染標(biāo)本中的分離率達(dá)50%，其中產(chǎn)ESBLs菌株的分離率更高，容易引起暴發(fā)流行[12]。此外，碳青霉烯酶耐藥的大腸埃希菌(carbapenem-resistant Escherichia coli，CREC)已成為全世界的公共衛(wèi)生威脅，而且碳青霉烯酶、ESBLs、AmpC酶等耐藥基因極易在菌株間傳播，導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生和擴(kuò)散，從而影響治療效果[7-10]。本研究結(jié)果顯示，67株侵襲性大腸埃希菌整體耐藥率不高，但對(duì)氨芐西林和復(fù)方新諾明有很高的耐藥率，對(duì)頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松和左氧氟沙星有較高耐藥率，這些藥物治療效果可能不佳；另外，本研究中未檢出亞胺培南、美羅培南或厄他培南耐藥的侵襲性大腸埃希菌，說(shuō)明67株侵襲性大腸埃希菌中無(wú)高耐藥的CREC，提示碳青霉烯類藥物對(duì)大腸埃希菌有較高的穩(wěn)定性。

兒童用藥有其獨(dú)特性，且有很多臨床限制，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可以優(yōu)先選擇毒性小的藥物，合理選擇使用抗生素[13]。病原菌耐藥基因檢測(cè)也是提高用藥針對(duì)性和治療有效性的關(guān)鍵[14-15]。本研究中共檢測(cè)了11種碳青霉烯酶基因，結(jié)果只檢測(cè)到NDM-1基因2株和OXA-1基因1株，說(shuō)明本研究中兒童侵襲性大腸埃希菌產(chǎn)耐碳青霉烯酶較少；5種ESBLs基因中，共檢出TEM-1基因42株和CTX-M-14基因23株；8種AmpC酶基因中，共檢出ACT-1基因43株、FOX-1基因30株、CIT-1基因2株、CMY-2基因2株和DHA-1基因1株。上述結(jié)果說(shuō)明，本研究中兒童侵襲性感染大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制主要是攜帶TEM-1、CTX-M-14、ACT-1和FOX-1等基因。

綜上所述，蘇州地區(qū)兒童侵襲性感染大腸埃希菌整體耐藥率不高，也未檢出CREC，但是攜帶了較高比例的ESBLs基因和AmpC酶基因，應(yīng)引起臨床醫(yī)師重視。