劉秋艷 段佩利 金燕飛 張海波

河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008

骨瘤康顆粒為國家級(jí)名中醫(yī)王祥麒教授臨床用于治療腎精虧虛型骨轉(zhuǎn)移癌的經(jīng)驗(yàn)方，處方由白芍、熟地黃、山慈菇、白芥子、川芎、皂角刺等十二味中藥組成，具有補(bǔ)腎填精、柔肝止痛、化痰散結(jié)的功效[1-2]。 骨瘤康顆粒臨床以湯劑入藥，味苦量大，服用不便，故將其研制成顆粒劑[3-5]。為控制制劑質(zhì)量，本研究參照文獻(xiàn)[6-14 ]采用薄層色譜法對(duì)方中熟地黃、川芎、白芍三味中藥進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)骨瘤康顆粒中芍藥苷含量進(jìn)行測(cè)定，從而保證制劑的安全性及有效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo U3000 高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器(美國賽默飛世爾科技公司)；Good Look-1000型全自動(dòng)薄層色譜成像系統(tǒng)(上?？普苌萍加邢薰?； EYELA N-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (日本 Rikakikai 公司); HK250型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)臺(tái)式超聲波清洗器)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥 骨瘤康顆粒三批中試樣品(批號(hào)20190407、20190413、20190422 )，芍藥苷對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為：X27F8C30162，含量≥98%) ；熟地黃對(duì)照藥材 (中國藥品生物制品檢定所)、川芎對(duì)照藥材(中國藥品生物制品檢定所)、乙腈、磷酸( 色譜純，天津四友)；水為超純水(自制)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 熟地黃薄層色譜鑒別 取骨瘤康顆粒10 g， 加水50 mL， 加熱至沸，放冷，離心，上清液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取熟地黃對(duì)照藥材4 g，加水60 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。另取缺熟地黃的陰性對(duì)照，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典》四部通則0502]試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液。置日光與紫外燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品無干擾。如圖1、圖2所示。

2.1.2 白芍薄層色譜鑒別 取骨瘤康顆粒 2.0 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取缺白芍的陰性對(duì)照品2.0 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典》四部通則0502]試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在l05℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性無干擾。如圖3所示。

2.1.3 川芎薄層色譜鑒別 取骨瘤康顆粒 2.0 g，加乙醚20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取川芎對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典》四部通則0502]試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn) 。陰性無干擾。如圖4所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為230 nm。

2.2.2 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備：取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取骨瘤康樣品2 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照溶液：按樣品處方比例及工藝制備不含白芍的陰性樣品,照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液,供試品溶液以及陰性對(duì)照品溶液各10 μL,分別進(jìn)樣。供試品與對(duì)照品在相應(yīng)位置處出現(xiàn)相同色譜峰，陰性對(duì)照在對(duì)照品峰相應(yīng)的位置上無干擾，說明專屬性良好。如圖5所示。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取濃度為200 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于10 mL量瓶中,用甲醇溶液配成濃度為10、20、40、80、120、160、200 μg/mL的對(duì)照品溶液,搖勻,分別吸取上述對(duì)照品溶液10μL進(jìn)樣,按設(shè)定色譜條件測(cè)定,濃度μg/mL為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:y=0.246x-0.2458，r=0.9996，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1及圖6。試驗(yàn)結(jié)果表明，芍藥苷在 20～200μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液(濃度：60 μg/mL),連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明:RSD為1.41%，表明使用該測(cè)定方法儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液,于0、2、4、6、12、24 h各測(cè)定峰面積(A)1次,結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明：RSD為0.64% ,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份,按供試品溶液制備并測(cè)定，結(jié)果見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明，RSD為0.45%，樣品重復(fù)性較好。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量同一批號(hào)的樣品1 mL,置50 mL量瓶中,平行取樣6份,精密加入濃度為60 μg/mL的對(duì)照品溶液0.45 mL、0.75 mL、1.05 mL各兩份，加稀乙醇35 mL,超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液 ,依法測(cè)定，計(jì)算回收率，RSD值，結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

由以上結(jié)果得出平均加樣回收率96.74%， RSD為 1.48%。說明此方法準(zhǔn)確可行。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取骨瘤康顆粒3批中試產(chǎn)品樣品每批2份。按2.2.2制備方法制得供試品溶液及對(duì)照品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)不同批次樣品進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷含量，結(jié)果見表6。

表6 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

由以上得出：三批骨瘤康顆粒樣品芍藥苷的含量在1.8541～2.0616 mg/g, 考慮到藥材的差異性，以及不同批次轉(zhuǎn)移率的不同，再加上樣品批次較少, 按最低含量下浮30%制訂骨瘤康顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中芍藥苷含量[11], 暫定骨瘤康顆粒中芍藥苷含量不少于1.30 mg/g。

3 討論

骨瘤康顆粒組方從“腎主骨生髓”的理論出發(fā)，以補(bǔ)腎為根本。方中熟地黃補(bǔ)腎填精，白芍柔肝止痛，二藥共為君藥。但熟地黃2015年版《中國藥典》規(guī)定其指標(biāo)性成分為毛蕊花糖苷， 在含量檢測(cè)指標(biāo)篩選時(shí)，預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中首先對(duì)熟地黃中所含指標(biāo)性成分毛蕊花糖苷進(jìn)行HPLC含量檢測(cè)方法研究。采用多種方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，供試品色譜中無相應(yīng)峰。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，毛蕊花糖苷不穩(wěn)定[15]，在長時(shí)間加熱過程中易發(fā)生美拉登反應(yīng)，因此無法作為含量控制指標(biāo)[16-18]。 2015年版《中國藥典》規(guī)定白芍的指標(biāo)性成分為芍藥苷。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)制劑中熟地黃、白芍、川芎、山慈菇、白芥子等中藥進(jìn)行薄層色譜定性鑒別研究。查閱文獻(xiàn)山慈菇暫未收載其薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)。白芥子薄層色譜鑒別陰性干擾嚴(yán)重，無法作為定性鑒別項(xiàng)。熟地黃、川芎、白芍薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，陰性無干擾，故將熟地黃、川芎、白芍作為該制劑的定性控制指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)對(duì)白芍的指標(biāo)性成分芍藥苷進(jìn)行HPLC含量檢測(cè)，在20～200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系,r=0.9996(n=6),平均加樣回收率96.74%，RSD為1.48%(n=6)。其方法專屬性好、精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，能較好控制主藥指標(biāo)成分含量?？勺鳛楣橇隹殿w粒的含量測(cè)定。

因此，利用薄層色譜法對(duì)骨瘤康顆粒中熟地黃、川芎、白芍三味中藥進(jìn)行定性鑒別，其斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)；使用HPLC法對(duì)骨瘤康顆粒中的芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為230 nm，其線性方程為y=0.246x-0.2458，r=0.9996，平均加樣回收率96.74%，RSD為1.48%(n=6)。 3批制劑中芍藥苷平均含量分別為1.9577，RSD值為3.76%。因此本實(shí)驗(yàn)所建立的熟地黃、川芎、白芍TCL鑒別方法及芍藥苷含量測(cè)定方法準(zhǔn)確易行,精密度、穩(wěn)定、重復(fù)性均較好,能有效控制骨瘤康顆粒制劑質(zhì)量。