管慶林,周笑犁,趙 姍,耿瑞鴻

(貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,貴州貴陽 550005)

番茄色澤鮮美酸甜可口、營養(yǎng)豐富,在我國是廣大消費(fèi)者日常最喜歡的果蔬之一,它可以抑制人體癌細(xì)胞的生長,對(duì)預(yù)防動(dòng)脈硬化、冠心病和高血壓具有極好的作用[1-2]。我國因獨(dú)特的地理?xiàng)l件,現(xiàn)已成為世界第三大番茄產(chǎn)區(qū),但其果實(shí)因含水量較高,易受致病菌的侵染導(dǎo)致腐敗,不能長期貯藏,因此在現(xiàn)有番茄醬、番茄汁等產(chǎn)品的基礎(chǔ)上亟需拓寬番茄的精深加工產(chǎn)品。果蔬酵素是以水果、蔬菜或其汁為原料,經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分食用的酵素產(chǎn)品[3-4]。酵素在發(fā)酵中會(huì)經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng),不僅能保留原料中原有的營養(yǎng)物質(zhì),而且還能產(chǎn)生一些活性物質(zhì),具有解酒護(hù)肝、潤通腸道、抗菌消炎、抗氧化及保健功能[5-7]。實(shí)驗(yàn)前期的研究結(jié)果表明,番茄經(jīng)過自然發(fā)酵后,其抗氧化物質(zhì)及其活性顯著提高[8],并且對(duì)調(diào)節(jié)血糖關(guān)鍵酶之一的α-淀粉酶具有一定的抑制作用[9]。但目前酵素的生產(chǎn)主要以傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝為主[10],參與發(fā)酵菌種多、發(fā)酵時(shí)間長,導(dǎo)致了發(fā)酵過程難以控制[11],使得番茄等果蔬酵素工業(yè)化生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)。

近年來,為縮短發(fā)酵周期,從果蔬自然發(fā)酵液中分離優(yōu)勢菌種成為了熱點(diǎn),如:凌空等[7]分別在6個(gè)月和18個(gè)月的果蔬酵素(蘋果、香蕉、橙子、葡萄、鴨梨、木瓜、菠蘿、山竹、李子、櫻桃、草莓、西紅柿、胡蘿卜和檸檬)中分離得到畢赤酵母;劉灝[12]從西紅柿酵素中分離得到的優(yōu)勢酵母為季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)和淺白隱球酵母(Cryptococcusalbidus);韋明明[13]從發(fā)酵番茄酸湯中分離出4株乳酸菌和2株酵母菌(東方伊薩酵母菌和畢赤酵母菌),也發(fā)現(xiàn)了這些酵母菌產(chǎn)香效果較好,可作為發(fā)酵的優(yōu)良菌種。酵母菌作為果蔬發(fā)酵中的優(yōu)勢菌種之一,因缺少分解纖維素、蛋白質(zhì)的酶系,能最大程度地保留發(fā)酵原料本身的色、香、味和口感[13];酵母菌分別在有氧、無氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸和各種醇類物質(zhì),構(gòu)成了產(chǎn)品風(fēng)味的主要物質(zhì)[13-15]。綜上所述,酵母菌對(duì)發(fā)酵制品的風(fēng)味形成和產(chǎn)品質(zhì)量具有重要作用,從番茄自然發(fā)酵液中分離優(yōu)勢酵母菌可以在一定程度上促進(jìn)番茄酵素的開發(fā)與應(yīng)用。

本文以30 d番茄自然發(fā)酵液為原料,對(duì)其中的酵母菌進(jìn)行分離、鑒定,并分析其生長特性及耐受特性,可為番茄酵素產(chǎn)品的開發(fā)提供菌種支持,同時(shí)對(duì)豐富酵母菌種類以及果蔬發(fā)酵劑的開發(fā)具有一定意義。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮無病害且果實(shí)飽滿、色澤均勻的番茄 購于沃爾瑪超市;酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基);10%HCl 分析純,天津渤化化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;葡萄糖 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、Premix Taq酶 生工生物工程(上海)股份有限公司。

YXQ-LS-50SII立式高壓滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-1G單人超凈工作臺(tái) 上海力辰邦西儀器科技有限公司;101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;DH5000BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;AUW120D電子分析天平 日本島津公司;UV2700紫外分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司;T100PCR擴(kuò)增儀 美國BIO-RAD公司;DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 美國BIO-RAD公司;Bioradchemidoc XRS凝膠成像分析儀 美國BIO-RAD公司;CX21顯微鏡 上海澤仕光電科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 番茄自然發(fā)酵液的制備 采用新鮮番茄為試材,按番茄與白砂糖質(zhì)量比3∶1混勻后置于1000 mL已滅菌的玻璃瓶中,封口,發(fā)酵初期每隔1 d通過排氣閥排氣,發(fā)酵10 d后每隔3 d排氣,室溫發(fā)酵30 d后制成發(fā)酵液[8-9]。

1.2.2 酵母菌的分離純化 取番茄發(fā)酵液制成10-2的稀釋液,取稀釋發(fā)酵液100 μL涂布于YPD培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d;挑取不同形態(tài)的單個(gè)菌落劃線接種于新鮮無污染的YPD培養(yǎng)基中,重復(fù)分離純化3次,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行鏡檢,將純化好的菌株放于4 ℃下保存?zhèn)溆肹16-17]。

1.2.3 酵母菌的形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[17]中酵母菌菌落的大小、顏色、表面光滑度、邊緣是否整齊、正面與反面以及邊緣與中央部位顏色是否一致進(jìn)行初步斷定,然后再在顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 a.分子生物學(xué)鑒定:參考岑濤等[18]、武偉偉等[19]實(shí)驗(yàn)方法,提取酵母菌DNA,根據(jù)真菌基因組DNA快速抽提試劑盒操作步驟提取DNA。PCR反應(yīng)體系(50 μL),模板DNA 2 μL,26S rDNA引物[NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′),NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)]各1 μL,Premix Taq酶25 μL,然后加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件,95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán),最終72 ℃延伸5 min,4 ℃保溫。PCR擴(kuò)增完成后,將2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠檢測,觀察有無特異性目的條帶出現(xiàn),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物最后送北京諾禾致源科技股份有限公司測序。

b.同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:將測序得到的基因序列登錄NCBI進(jìn)行BLAST同源性比對(duì),并在MEGA7軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定(用自展法(bootstrap)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹,自展數(shù)據(jù)集為1000)。

1.2.5 酵母菌的生長特性及耐受性分析

1.2.5.1 酵母菌的生長特性分析 參考賈春鳳等[20]、魏立杰等[21]試驗(yàn)方法:a. 溫度對(duì)酵母菌生長的影響:在YPD培養(yǎng)基中接入10%的酵母菌液,分別置于25、29、33和37 ℃下培養(yǎng)24和48 h后測OD610 nm值。b. pH對(duì)酵母菌生長的影響:分別在pH為3.5、4、4.5、5、5.5、6的YPD培養(yǎng)液中,接入10%的酵母菌液,于28 ℃下培養(yǎng)24和48 h后測OD610 nm值。

1.2.5.2 酵母菌的耐受性研究 參考試驗(yàn)方法[21-23]:a.酵母菌對(duì)糖的耐受性分析:分別接種10%酵母菌于10%、20%、30%、40%、50%葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中,28 ℃下培養(yǎng)48 h后測OD610 nm值。b.酵母菌對(duì)酒精的耐受性分析:分別接種10%酵母菌于6%、9%、12%、15%、18%酒精度的培養(yǎng)基中,28 ℃下培養(yǎng)48 h后測OD610 nm值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用IBM SPSS 22.0數(shù)據(jù)編輯器Duncan(D)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和方差分析,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),最后用Graph Pad Prism v8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的形態(tài)學(xué)特征

從番茄自然發(fā)酵液中分離純化得到3株具有疑似酵母菌菌落形態(tài)的菌株,編號(hào)分別為TY-1、TY-2和TY-3,其在YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見表1,3株菌的菌落均不透明、邊緣整齊、正反面和邊緣、中央部位的顏色均一,而TY-1、TY-2相對(duì)TY-3的菌落較濕潤且易挑起。3株菌在YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖1,通過在顯微鏡下觀察,3株菌的細(xì)胞形態(tài)均為橢圓形,TY-1、TY-2頂端無出芽現(xiàn)象,而TY-3頂端出芽。因此,初步判斷為畢赤酵母或釀酒酵母[17,24]。

圖1 菌落及細(xì)胞形態(tài)特征Fig.1 Colony and cell morphology

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)番茄自然發(fā)酵液中分離得到的3株菌26S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖2所示,3株菌的瓊脂糖凝膠電泳條帶明亮清晰且無明顯拖帶現(xiàn)象,分子量均為750 bp左右,符合測序要求。

圖2 26S rDNA擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Amplification of 26S rDNA

將測序結(jié)果輸入NCBI進(jìn)行BLAST同源性比對(duì),這些序列與NCBI上提交相應(yīng)系列的Query coverage值達(dá)100%,Percent identity值達(dá)887,基于26S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。TY-1、TY-2和TY-3均屬于畢赤酵母屬(Pichia)中的庫德畢赤酵母(P.kudriavzevii),其中TY-1和TY-2均與P.kudriavzeviistrain SLDY-035菌株的同源性為99%,與P.kudriavzeviistrain CBS573的同源性為95%,由于兩株菌的親緣關(guān)系較近,故選取一株菌(TY-1)進(jìn)行后續(xù)生長特性及耐受性試驗(yàn)。TY-3與P.kudriavzeviismallsubunitribosomal菌株的同源性為100%,與P.kudriavzeviistrain SSY 02和P.kudriavzeviistrain AMC PK002的同源性為98%。杜晶等[14]從楊梅果酒中篩選出克魯弗畢赤酵母和庫德畢赤酵母;韋明明[13]從發(fā)酵番茄酸湯中分離出東方伊薩酵母菌和畢赤酵母菌;魏東東等[24]從紅樹莓酵素中分離出優(yōu)勢酵母為庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)2株,盔形畢赤酵母(Pichiamanshurica)1株;兩者從果蔬酵素中分離出的優(yōu)勢酵母菌均為畢赤酵母屬(Pichia),與本試驗(yàn)結(jié)果相似,說明果蔬發(fā)酵液中的優(yōu)勢酵母菌為畢赤酵母屬,但由于發(fā)酵原料、產(chǎn)地的不同導(dǎo)致畢赤酵母屬中的種存在一定差異。

圖3 基于26S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence

2.3 酵母菌的生長特性及耐受性分析

2.3.1 不同溫度對(duì)酵母生長的影響 溫度是影響酵母菌生長的重要因素,可以影響酶活性和酵母菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,而不同的酵母菌最適生長溫度也有所差異[17,25]。如圖4所示,TY-1和TY-3分別培養(yǎng)24和48 h后,其OD值隨著溫度的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢;其中,TY-1和TY-3在29 ℃時(shí)菌體密度達(dá)到最大值;隨著溫度繼續(xù)上升,兩株菌的菌體密度迅速降低(P<0.05),可能是溫度的升高抑制了酵母菌的生長?？梢?29 ℃為TY-1和TY-3最適生長溫度,和溫洪宇等[26]從發(fā)酵醋醅分離得到的季也蒙畢赤酵母的最佳生長溫度為30 ℃相似。

圖4 溫度對(duì)TY-1和TY-3生長的影響Fig.4 Effects of temperature on the growth of TY-1 and TY-3注:圖中各組的不同字母表示 顯著差異,P<0.05；圖5～圖7同。

2.3.2 不同pH對(duì)酵母菌生長的影響 pH對(duì)酵母菌的生長代謝有較大影響,能影響細(xì)胞間的代謝傳遞及酶活性,在較低或者較高的pH下可使酵母菌死亡[27]。如圖5所示,菌株培養(yǎng)24、48 h后,兩株菌在不同pH下的變化趨勢相近,當(dāng)pH為3.5～6,菌體密度呈先增加后降低的趨勢,其中在培養(yǎng)24 h后,pH為5.5時(shí)菌體密度達(dá)到最大,但與pH為5.0時(shí)的OD值差異不顯著(P>0.05);而培養(yǎng)48 h后,pH為5.5時(shí)菌體密度達(dá)到最大(P<0.05);隨著pH繼續(xù)上升,兩株菌體的菌體密度迅速降低(P<0.05),可能是較高pH抑制了酵母菌細(xì)胞間物質(zhì)交換或酶活性。因此,pH5.5為番茄發(fā)酵液中酵母菌生長的最適pH。陶森等[28]研究表明季也蒙畢赤酵母菌最佳pH在5～6之間,這與本試驗(yàn)結(jié)果相似;而韋元琪等[29]從酒曲中分離得到1株庫德畢赤酵母的最適pH為6.0,這可能是發(fā)酵底物不同,使得庫德畢赤酵母的最適pH有所差異。

圖5 pH對(duì)TY-1和TY-3生長的影響Fig.5 Effects of pH on the growth of TY-1 and TY-3

2.3.3 酵母菌對(duì)葡萄糖的耐受性分析 添加一定糖濃度可以為酵母菌的生長提供必需的碳源,但在較高濃度下會(huì)改變酵母菌細(xì)胞膜的滲透壓從而抑制其生長[26]。如圖6所示,兩株菌在不同糖濃度下變化趨勢基本相近,菌體密度吸光度值隨著糖濃度的增加呈現(xiàn)不斷降低的趨勢。當(dāng)糖濃度為10%時(shí)菌體密度顯著高于其他各組(P<0.05),而濃度高于30%后,兩株菌幾乎不生長,可能是較高糖濃度抑制了TY-1和TY-3的生長,但在糖濃度為40%～50%時(shí)TY-1的耐受性略強(qiáng)于TY-3(P<0.05)。伍強(qiáng)等[30]從獼猴桃果肉中分離出的庫德畢赤酵母在25%糖濃度下能良好的生長,但糖濃度達(dá)到35%時(shí),該菌幾乎不能生長;杜晶等[14]從楊梅果酒中分離的畢赤酵母在糖含量超過30%時(shí)其生長開始受到抑制,而釀酒酵母則在糖含量為50%時(shí)仍能很好地進(jìn)行發(fā)酵。本試驗(yàn)番茄自然發(fā)酵液中分離得到的菌株耐糖能力略低于獼猴桃中分離的畢赤酵母和楊梅果酒中的克魯弗畢赤酵母、庫德里阿茲威氏畢赤酵母,這為該菌作為果蔬發(fā)酵劑的使用提供理論依據(jù)。

2.3.4 酵母菌對(duì)酒精的耐受性分析 酵母菌對(duì)酒精的耐受能力是影響酵母菌發(fā)酵的重要因素,如果酵母菌對(duì)酒精的耐受性差則使發(fā)酵難以繼續(xù)[31]。從圖7中可以看出,兩株菌的生長變化趨勢基本相同,隨著酒精濃度的增加，菌體密度逐漸降低。TY-3菌在酒精濃度為6%時(shí)吸光度值最大(P<0.05),隨著酒精濃度的增加其OD值顯著降低(P<0.05);而TY-1菌在酒精濃度為6%～9%時(shí)生長差異不顯著(P>0.05),當(dāng)酒精濃度高于9%后,生長受到顯著抑制(P<0.05);但均低于TY-3的OD值。由此可見,番茄發(fā)酵液中分離得到的TY-1較TY-3具有較寬的酒精耐受性范圍。伍強(qiáng)等[30]從獼猴桃果肉中分離出的野生酵母菌克魯維畢赤酵母或庫德畢赤酵母,在12%的酒精濃度下發(fā)酵能力顯著降低;郝瑤等[32]分離的庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)在酒精度≥12%時(shí),菌株基本不生長;以上研究與本文結(jié)果一致。

圖7 不同濃度的酒精對(duì)TY-1和TY-3生長影響Fig.7 Effects of different concentrations of alcohol on the growth of TY-1 and TY-3

3 結(jié)論

本研究從30 d番茄自然發(fā)酵液中分離得到3株菌,采用26S rDNA特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序,將其擴(kuò)增序列與NCBI中的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析得到3株菌均為畢赤酵母屬(Pichia)中的庫德畢赤酵母種(P.kudriavzevii),其中TY-1和TY-2親緣關(guān)系較近,與P.kudriavzeviistrain SLDY-035菌株的同源性為99%;TY-3與P.kudriavzeviismallsubunitribosomal菌株的同源性為100%。TY-1、TY-3菌的最適生長溫度為29 ℃、最適pH為5.5,對(duì)酒精和葡萄糖具有一定的耐受能力。這為番茄酵素高效發(fā)酵劑的制備奠定菌種基礎(chǔ),如再經(jīng)過進(jìn)一步馴化,各菌株將會(huì)更好地適應(yīng)果蔬發(fā)酵環(huán)境,從而表現(xiàn)出更好的發(fā)酵性能,這對(duì)研究開發(fā)功能性微生物酵素產(chǎn)品及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)具有一定意義。