李 蓉，趙 佳，伍一紅，胡方凡

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410128

霜霉威是一種具有局部內(nèi)吸作用的低毒殺菌劑，屬于氨基甲酸酯類，具有安全、高效、新型等特點，其作用機(jī)理是通過抑制病菌細(xì)胞膜成分的磷酸和脂肪酸的合成，抑制菌絲生長蔓延和孢子囊的形成及孢子萌發(fā)，進(jìn)而抑制病菌的生長，霜霉威對卵菌綱真菌有特效(馮大軍，2011；占繡萍等，2017)。霜霉威的制劑一般為霜霉威鹽酸鹽水劑，可進(jìn)行葉面噴霧，因其具有安全、高效等特性，能促進(jìn)作物生長和增加產(chǎn)量，對辣椒CapsicumannuumL.、花椰菜BrassicaoleraceaL.var.botrytisL、白菜Brassicapekinensis(Lour.)Rupr等農(nóng)作物的霜霉病、疫病、黑脛病等有較好的防治效果(劉彥良等，2007；Sahooetal.，2014；Sharmaetal.，2016)。

霜霉威的檢測方法有很多，已有研究采用氣相色譜法快速測定土壤中霜霉威殘留情況，或采用液相色譜法測定霜霉威農(nóng)藥原藥含量(金濤等，2018；李飛飛等，2010；張翠芳等，2018)。潘艷坤和韋英亮(2012)應(yīng)用凝膠滲透色譜凈化，液質(zhì)聯(lián)用法測定糧谷中的霜霉威殘留，但該方法使用的凝膠滲透凈化系統(tǒng)儀器價格昂貴，消耗的試劑量大，且凈化過程耗時較長。此外，采用氣相或液相與質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定蔬菜中的霜霉威也已有報道(柳亞男等，2015；劉潤珠等，2012；于福利等，2017)。

黃瓜CucumissativusL.是一種重要的可鮮食類蔬菜，與糧食作物不同，蔬菜內(nèi)吸性較強(qiáng)，農(nóng)藥噴灑后容易被蔬菜組織內(nèi)部吸收，殘留的農(nóng)藥在人體內(nèi)蓄積會造成慢性中毒甚至有致畸和致癌風(fēng)險(雷國明，2007)。我國有近80%的農(nóng)民使用霜霉威防治黃瓜霜霉病(吳鵬等，2011)，生產(chǎn)上大劑量使用導(dǎo)致霜霉威殘留成為影響黃瓜品質(zhì)的重要問題(李勝男等，2016)。韋麗妮(2012)對72.2%霜霉威水劑在黃瓜上的測定方法進(jìn)行了探討，然而對其消解趨勢和殘留情況未作詳細(xì)報道。本研究使用66.5%的霜霉威鹽酸鹽水劑在遼寧沈陽、內(nèi)蒙古呼和浩特、山西運(yùn)城、河北石家莊、山東青島、河南濟(jì)源、浙江杭州、湖南長沙、湖北恩施、廣西南寧、云南昆明、福建廈門等地進(jìn)行田間試驗，研究霜霉威在黃瓜和土壤中的消解規(guī)律及其最終殘留情況，為該藥在黃瓜上的科學(xué)合理使用及限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設(shè)備

供試作物：黃瓜。

試驗材料：霜霉威鹽酸鹽水劑原藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，無水MgSO4，NaCl，甲酸，均為分析純，乙腈(色譜純)，40～60 μm的N-丙基乙二胺(Agela Technologies)。

儀器設(shè)備：1290Ⅱ-6470LC-MS/MS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(安捷倫公司)；HY-BⅡ回旋振蕩器(江蘇金怡儀器科技有限公司)。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 消解動態(tài)田間試驗 依據(jù)《農(nóng)藥登記質(zhì)量要求》(中華人民共和國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部，2017a)和《農(nóng)藥登記質(zhì)量管理規(guī)范》(中華人民共和國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部，2017b)的有關(guān)規(guī)定，在湖南長沙、廣西南寧、浙江杭州、山東青島4地開展消解動態(tài)田間試驗。依據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》(中華人民共和國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司，2018)進(jìn)行試驗設(shè)計及樣品采集處理。設(shè)置試驗小區(qū)50 m2，施藥劑量108.6 g·hm-2。2018年7月3日，按常規(guī)方法對黃瓜噴撒農(nóng)藥(兌水噴霧，用水量450 L·hm-2)，施藥2次，施藥間隔期7 d。分別在第2次施藥后2 h及1、7 d進(jìn)行樣品采集。在試驗小區(qū)隨機(jī)取12株黃瓜的不同方向及不同部位(包括上、中、下、里、外等5個部位)采集2 kg以上生長正常、無病害的黃瓜果實樣品，每個小區(qū)采集2份獨立樣品。

1.2.2 最終殘留田間試驗 2018年7—12月，分別在遼寧沈陽、內(nèi)蒙古呼和浩特、山西運(yùn)城、河北石家莊、山東青島、河南濟(jì)源、浙江杭州、湖南長沙、湖北恩施、廣西南寧、云南昆明、福建廈門等12個地點開展田間試驗。每個試驗地設(shè)置一個處理小區(qū)和空白對照小區(qū)，每個試驗小區(qū)50 m2。施藥劑量108.6 g·hm-2，施藥2次，兌水噴霧，用水量450 L·hm-2，施藥間隔期7 d；分別在第2次施藥后3、5 d采集樣品。如遇天氣或其他原因無法按期采收樣品，可于預(yù)定日期2 d內(nèi)采樣。在試驗小區(qū)隨機(jī)取12株黃瓜的不同方向及不同部位(包括上、中、下、里、外等5個部位)采集2 kg以上生長正常、無病害的黃瓜果實樣品，每個小區(qū)采集2份獨立樣品。第1次采樣時同時采集空白對照樣品。

1.3 分析方法

1.3.1 提取與凈化 稱取已制備好的黃瓜樣品5 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋3 min，再加入2 g NaCl，渦旋1 min后，3000 r·min-1離心5 min。取上清液2 mL，加入75 mg N-丙基乙二胺和0.5 g無水MgSO4，渦旋1 min，5000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18(1.8 μm ×2.1 mm×50 mm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相采用的梯度洗脫條件見表1，圖1為66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖。

圖1 66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖

表1 梯度洗脫條件

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；正離子噴霧電壓：3000 V；霧化氣壓力：0.31 MPa；干燥氣溫度：110 ℃；干燥氣流速：12 L·min-1；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L·min-1;檢測離子對、碰撞能量和錐孔電壓見表2。

表2 離子選擇參數(shù)表

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取霜霉威水劑原藥0.0333 g，用乙腈溶解并定容至50 mL，得到300 μg·mL-1標(biāo)樣母液，再分別用乙腈稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。按1.3.2液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測條件進(jìn)行測定，得到霜霉威鹽酸鹽水劑線性方程：Y=9977364.86X+549661.60，相關(guān)系數(shù)為0.9947，表明在0.01～1.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)。

圖2 霜霉威鹽酸鹽水劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 添加回收試驗與檢出限

在5 g黃瓜樣品中添加不同濃度(0.05、0.15、1.50、5.00 mg·kg-1)的霜霉威鹽酸鹽水劑標(biāo)樣溶液，每個濃度重復(fù)5次。LC-MS/MS通過霜霉威鹽酸鹽水劑母離子189.1 m·z-1，碎片離子144.1、102.0 m·z-1進(jìn)行定性。黃瓜中的霜霉威回收率為72%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.7%～3.2%(表3)。在1.3.2液相色譜-質(zhì)譜條件下霜霉威鹽酸鹽水劑的最小檢出量為5.0×10-11g，定量限為0.05 mg·kg-1。圖3為黃瓜樣品中添加0.15 mg·kg-1的霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖。

表3 霜霉威在黃瓜上的回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖3 黃瓜樣品中添加霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖

2.2 霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動態(tài)

由圖4可見，隨著時間的延長，霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的殘留量逐漸降低。在湖南長沙、浙江杭州、廣西南寧3地，黃瓜上的農(nóng)藥殘留量變化趨勢符合一級動力學(xué)方程Ct=C0e-kt，3個試驗地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動態(tài)曲線方程分別為Y=0.0671e-0.164X、Y=0.3699e-0.141X和Y=0.2821e-0.608X，其相關(guān)系數(shù)分別為0.9995、0.7963和0.9953。山東青島試驗地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動態(tài)曲線未得出。霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的半衰期為1.1～4.9 d，屬于易降解農(nóng)藥(T1/2<30 d)。廣西南寧試驗地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的半衰期最短(1.1 d)，浙江杭州與湖南長沙試驗地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的半衰期相近，分別為4.9和4.2 d。

圖4 霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動態(tài)曲線

2.3 霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜中的最終殘留

從表4最終殘留降解試驗結(jié)果看，施藥后3 d霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜中的殘留量為(<0.05)～0.55 mg·kg-1；施藥后5 d，霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜中的殘留量為(<0.05)～0.40 mg·kg-1。湖南長沙、浙江杭州、湖北恩施、云南昆明、河南濟(jì)源、山西運(yùn)城等地施藥后5 d采集的樣品中農(nóng)藥的最終殘留量高于施藥后3 d采集的樣品。

表4 霜霉威鹽酸鹽水劑在不同試驗地點黃瓜中的最終殘留量

3 討論與小結(jié)

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定黃瓜中66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量，在0.01～1.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積和濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9947。在霜霉威鹽酸鹽水劑添加濃度為0.05、0.15、1.50、5.00 mg·kg-1時，其添加回收率72%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.7%～3.2%，均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》(中華人民共和國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司，2018)要求。

湖南長沙、廣西南寧、浙江杭州、山東青島4地的消解動態(tài)試驗表明，隨著時間的延長，霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的殘留量逐漸降低。其中，廣西南寧的霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量半衰期最短(1.1 d)，浙江杭州試驗地霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量與湖南長沙試驗地的殘留量半衰期相近(分別為4.9和4.2 d)。盡管這3地的土壤類型不同，但是3地黃瓜樣品上的霜霉威鹽酸水劑鹽殘留量變化趨勢基本一致，均符合一級動力學(xué)方程Ct=C0e-kt。因此，土壤并非是影響霜霉威消解的主要因素，這與測定霜霉威在番茄LycopersiconesculentumMill.和土壤中的消解動態(tài)一致，半衰期在1.1～4.9 d之間(柳亞男，2015)，這也說明了霜霉威鹽酸鹽水劑屬于易降解農(nóng)藥。

本研究表明，12個試驗地黃瓜樣品中霜霉威鹽酸鹽水劑的殘留量為(<0.05)～0.55 mg·kg-1。而在第2次施藥后5 d采集的黃瓜樣品中，霜霉威鹽酸鹽水劑的殘留量在有些試驗地出現(xiàn)了高于在施藥后3 d采集的樣品的殘留量，這可能是施藥不均和采樣隨機(jī)性等因素所致，這與魚藤酮和印楝素在黃瓜和土壤(陳妍和劉新社，2019)、啶蟲脒在黃瓜和土壤(丁悅等，2014)及噻蟲嗪在棉花和土壤(梁旭陽等，2013)中殘留及消解動態(tài)一致。我國規(guī)定霜霉威最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)值是5 mg·kg-1(中華人民共和國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部，2019)，第2次施藥后3 d采集的樣品中，霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量最大值0.55 mg·kg-1，低于其所規(guī)定的最大殘留量，可以安全使用，因此推薦安全間隔期3 d。