李 蓉，趙 佳，伍一紅，胡方凡

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128

霜霉威是一種具有局部?jī)?nèi)吸作用的低毒殺菌劑，屬于氨基甲酸酯類，具有安全、高效、新型等特點(diǎn)，其作用機(jī)理是通過(guò)抑制病菌細(xì)胞膜成分的磷酸和脂肪酸的合成，抑制菌絲生長(zhǎng)蔓延和孢子囊的形成及孢子萌發(fā)，進(jìn)而抑制病菌的生長(zhǎng)，霜霉威對(duì)卵菌綱真菌有特效(馮大軍，2011；占繡萍等，2017)。霜霉威的制劑一般為霜霉威鹽酸鹽水劑，可進(jìn)行葉面噴霧，因其具有安全、高效等特性，能促進(jìn)作物生長(zhǎng)和增加產(chǎn)量，對(duì)辣椒CapsicumannuumL.、花椰菜BrassicaoleraceaL.var.botrytisL、白菜Brassicapekinensis(Lour.)Rupr等農(nóng)作物的霜霉病、疫病、黑脛病等有較好的防治效果(劉彥良等，2007；Sahooetal.，2014；Sharmaetal.，2016)。

霜霉威的檢測(cè)方法有很多，已有研究采用氣相色譜法快速測(cè)定土壤中霜霉威殘留情況，或采用液相色譜法測(cè)定霜霉威農(nóng)藥原藥含量(金濤等，2018；李飛飛等，2010；張翠芳等，2018)。潘艷坤和韋英亮(2012)應(yīng)用凝膠滲透色譜凈化，液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定糧谷中的霜霉威殘留，但該方法使用的凝膠滲透凈化系統(tǒng)儀器價(jià)格昂貴，消耗的試劑量大，且凈化過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)。此外，采用氣相或液相與質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定蔬菜中的霜霉威也已有報(bào)道(柳亞男等，2015；劉潤(rùn)珠等，2012；于福利等，2017)。

黃瓜CucumissativusL.是一種重要的可鮮食類蔬菜，與糧食作物不同，蔬菜內(nèi)吸性較強(qiáng)，農(nóng)藥噴灑后容易被蔬菜組織內(nèi)部吸收，殘留的農(nóng)藥在人體內(nèi)蓄積會(huì)造成慢性中毒甚至有致畸和致癌風(fēng)險(xiǎn)(雷國(guó)明，2007)。我國(guó)有近80%的農(nóng)民使用霜霉威防治黃瓜霜霉病(吳鵬等，2011)，生產(chǎn)上大劑量使用導(dǎo)致霜霉威殘留成為影響黃瓜品質(zhì)的重要問(wèn)題(李勝男等，2016)。韋麗妮(2012)對(duì)72.2%霜霉威水劑在黃瓜上的測(cè)定方法進(jìn)行了探討，然而對(duì)其消解趨勢(shì)和殘留情況未作詳細(xì)報(bào)道。本研究使用66.5%的霜霉威鹽酸鹽水劑在遼寧沈陽(yáng)、內(nèi)蒙古呼和浩特、山西運(yùn)城、河北石家莊、山東青島、河南濟(jì)源、浙江杭州、湖南長(zhǎng)沙、湖北恩施、廣西南寧、云南昆明、福建廈門(mén)等地進(jìn)行田間試驗(yàn)，研究霜霉威在黃瓜和土壤中的消解規(guī)律及其最終殘留情況，為該藥在黃瓜上的科學(xué)合理使用及限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

供試作物：黃瓜。

試驗(yàn)材料：霜霉威鹽酸鹽水劑原藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，無(wú)水MgSO4，NaCl，甲酸，均為分析純，乙腈(色譜純)，40～60 μm的N-丙基乙二胺(Agela Technologies)。

儀器設(shè)備：1290Ⅱ-6470LC-MS/MS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(安捷倫公司)；HY-BⅡ回旋振蕩器(江蘇金怡儀器科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)田間試驗(yàn) 依據(jù)《農(nóng)藥登記質(zhì)量要求》(中華人民共和國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部，2017a)和《農(nóng)藥登記質(zhì)量管理規(guī)范》(中華人民共和國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部，2017b)的有關(guān)規(guī)定，在湖南長(zhǎng)沙、廣西南寧、浙江杭州、山東青島4地開(kāi)展消解動(dòng)態(tài)田間試驗(yàn)。依據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》(中華人民共和國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司，2018)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集處理。設(shè)置試驗(yàn)小區(qū)50 m2，施藥劑量108.6 g·hm-2。2018年7月3日，按常規(guī)方法對(duì)黃瓜噴撒農(nóng)藥(兌水噴霧，用水量450 L·hm-2)，施藥2次，施藥間隔期7 d。分別在第2次施藥后2 h及1、7 d進(jìn)行樣品采集。在試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)取12株黃瓜的不同方向及不同部位(包括上、中、下、里、外等5個(gè)部位)采集2 kg以上生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的黃瓜果實(shí)樣品，每個(gè)小區(qū)采集2份獨(dú)立樣品。

1.2.2 最終殘留田間試驗(yàn) 2018年7—12月，分別在遼寧沈陽(yáng)、內(nèi)蒙古呼和浩特、山西運(yùn)城、河北石家莊、山東青島、河南濟(jì)源、浙江杭州、湖南長(zhǎng)沙、湖北恩施、廣西南寧、云南昆明、福建廈門(mén)等12個(gè)地點(diǎn)開(kāi)展田間試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)地設(shè)置一個(gè)處理小區(qū)和空白對(duì)照小區(qū)，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)50 m2。施藥劑量108.6 g·hm-2，施藥2次，兌水噴霧，用水量450 L·hm-2，施藥間隔期7 d；分別在第2次施藥后3、5 d采集樣品。如遇天氣或其他原因無(wú)法按期采收樣品，可于預(yù)定日期2 d內(nèi)采樣。在試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)取12株黃瓜的不同方向及不同部位(包括上、中、下、里、外等5個(gè)部位)采集2 kg以上生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的黃瓜果實(shí)樣品，每個(gè)小區(qū)采集2份獨(dú)立樣品。第1次采樣時(shí)同時(shí)采集空白對(duì)照樣品。

1.3 分析方法

1.3.1 提取與凈化 稱取已制備好的黃瓜樣品5 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋3 min，再加入2 g NaCl，渦旋1 min后，3000 r·min-1離心5 min。取上清液2 mL，加入75 mg N-丙基乙二胺和0.5 g無(wú)水MgSO4，渦旋1 min，5000 r·min-1離心5 min，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18(1.8 μm ×2.1 mm×50 mm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相采用的梯度洗脫條件見(jiàn)表1，圖1為66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖。

圖1 66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖

表1 梯度洗脫條件

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；正離子噴霧電壓：3000 V；霧化氣壓力：0.31 MPa；干燥氣溫度：110 ℃；干燥氣流速：12 L·min-1；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L·min-1;檢測(cè)離子對(duì)、碰撞能量和錐孔電壓見(jiàn)表2。

表2 離子選擇參數(shù)表

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取霜霉威水劑原藥0.0333 g，用乙腈溶解并定容至50 mL，得到300 μg·mL-1標(biāo)樣母液，再分別用乙腈稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。按1.3.2液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，得到霜霉威鹽酸鹽水劑線性方程：Y=9977364.86X+549661.60，相關(guān)系數(shù)為0.9947，表明在0.01～1.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)。

圖2 霜霉威鹽酸鹽水劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 添加回收試驗(yàn)與檢出限

在5 g黃瓜樣品中添加不同濃度(0.05、0.15、1.50、5.00 mg·kg-1)的霜霉威鹽酸鹽水劑標(biāo)樣溶液，每個(gè)濃度重復(fù)5次。LC-MS/MS通過(guò)霜霉威鹽酸鹽水劑母離子189.1 m·z-1，碎片離子144.1、102.0 m·z-1進(jìn)行定性。黃瓜中的霜霉威回收率為72%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.7%～3.2%(表3)。在1.3.2液相色譜-質(zhì)譜條件下霜霉威鹽酸鹽水劑的最小檢出量為5.0×10-11g，定量限為0.05 mg·kg-1。圖3為黃瓜樣品中添加0.15 mg·kg-1的霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖。

表3 霜霉威在黃瓜上的回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖3 黃瓜樣品中添加霜霉威鹽酸鹽水劑色譜圖

2.2 霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動(dòng)態(tài)

由圖4可見(jiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的殘留量逐漸降低。在湖南長(zhǎng)沙、浙江杭州、廣西南寧3地，黃瓜上的農(nóng)藥殘留量變化趨勢(shì)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e-kt，3個(gè)試驗(yàn)地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動(dòng)態(tài)曲線方程分別為Y=0.0671e-0.164X、Y=0.3699e-0.141X和Y=0.2821e-0.608X，其相關(guān)系數(shù)分別為0.9995、0.7963和0.9953。山東青島試驗(yàn)地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動(dòng)態(tài)曲線未得出。霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的半衰期為1.1～4.9 d，屬于易降解農(nóng)藥(T1/2<30 d)。廣西南寧試驗(yàn)地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的半衰期最短(1.1 d)，浙江杭州與湖南長(zhǎng)沙試驗(yàn)地的霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的半衰期相近，分別為4.9和4.2 d。

圖4 霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的消解動(dòng)態(tài)曲線

2.3 霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜中的最終殘留

從表4最終殘留降解試驗(yàn)結(jié)果看，施藥后3 d霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜中的殘留量為(<0.05)～0.55 mg·kg-1；施藥后5 d，霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜中的殘留量為(<0.05)～0.40 mg·kg-1。湖南長(zhǎng)沙、浙江杭州、湖北恩施、云南昆明、河南濟(jì)源、山西運(yùn)城等地施藥后5 d采集的樣品中農(nóng)藥的最終殘留量高于施藥后3 d采集的樣品。

表4 霜霉威鹽酸鹽水劑在不同試驗(yàn)地點(diǎn)黃瓜中的最終殘留量

3 討論與小結(jié)

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定黃瓜中66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量，在0.01～1.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積和濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9947。在霜霉威鹽酸鹽水劑添加濃度為0.05、0.15、1.50、5.00 mg·kg-1時(shí)，其添加回收率72%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.7%～3.2%，均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》(中華人民共和國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司，2018)要求。

湖南長(zhǎng)沙、廣西南寧、浙江杭州、山東青島4地的消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，霜霉威鹽酸鹽水劑在黃瓜上的殘留量逐漸降低。其中，廣西南寧的霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量半衰期最短(1.1 d)，浙江杭州試驗(yàn)地霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量與湖南長(zhǎng)沙試驗(yàn)地的殘留量半衰期相近(分別為4.9和4.2 d)。盡管這3地的土壤類型不同，但是3地黃瓜樣品上的霜霉威鹽酸水劑鹽殘留量變化趨勢(shì)基本一致，均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e-kt。因此，土壤并非是影響霜霉威消解的主要因素，這與測(cè)定霜霉威在番茄LycopersiconesculentumMill.和土壤中的消解動(dòng)態(tài)一致，半衰期在1.1～4.9 d之間(柳亞男，2015)，這也說(shuō)明了霜霉威鹽酸鹽水劑屬于易降解農(nóng)藥。

本研究表明，12個(gè)試驗(yàn)地黃瓜樣品中霜霉威鹽酸鹽水劑的殘留量為(<0.05)～0.55 mg·kg-1。而在第2次施藥后5 d采集的黃瓜樣品中，霜霉威鹽酸鹽水劑的殘留量在有些試驗(yàn)地出現(xiàn)了高于在施藥后3 d采集的樣品的殘留量，這可能是施藥不均和采樣隨機(jī)性等因素所致，這與魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤(陳妍和劉新社，2019)、啶蟲(chóng)脒在黃瓜和土壤(丁悅等，2014)及噻蟲(chóng)嗪在棉花和土壤(梁旭陽(yáng)等，2013)中殘留及消解動(dòng)態(tài)一致。我國(guó)規(guī)定霜霉威最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)值是5 mg·kg-1(中華人民共和國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部，2019)，第2次施藥后3 d采集的樣品中，霜霉威鹽酸鹽水劑殘留量最大值0.55 mg·kg-1，低于其所規(guī)定的最大殘留量，可以安全使用，因此推薦安全間隔期3 d。