邵建群 李青原 李風(fēng)華 石 晨 王玉記 張 楓

(首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，北京 100069)

檸檬烯(limonene)屬于單萜類化合物，學(xué)名為1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)已烯，為無色或淡黃色的油狀液體。檸檬烯大量存在于柑橘類植物的果皮中，主要以D-檸檬烯形式存在，是一種天然的活性單萜[1-2]。檸檬烯不僅廣泛應(yīng)用于香精香料領(lǐng)域，由于檸檬烯具有多種生物活性和藥理作用，可以作為止痛祛痰、消炎鎮(zhèn)咳的藥物加以應(yīng)用[3]。研究[4-6]表明，檸檬烯對很多細(xì)菌和真菌都具有較強(qiáng)的抗菌活性；具有較強(qiáng)的抗氧化作用[7-8]，是一種天然的抗氧化劑，可用于食品的保鮮[9-10]。國內(nèi)外的研究[11-14]還顯示，檸檬烯可以抗腫瘤，具有抑制細(xì)胞周期與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移的作用。檸檬烯廣泛存在于天然植物中，鑒于檸檬烯的多種食用和藥用價(jià)值，合理的開發(fā)可最大程度地利用這些天然資源。而檸檬烯含量的多少是一個(gè)重要檢測指標(biāo)，檸檬烯的測定方法也有一些文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道。本文采用水蒸氣蒸餾法先從柑橘的果皮中提取得到揮發(fā)油，然后對揮發(fā)油中檸檬烯的含量進(jìn)行氣相色譜的定量分析。按本文所建立的方法，筆者對市場上銷售的多種柑橘果皮提取到的揮發(fā)油進(jìn)行了檸檬烯含量的測定。

柑橘果皮是柑橘類產(chǎn)品的副產(chǎn)物，大量丟棄也會引起環(huán)境污染，而要變廢為寶從柑橘果皮中提取其揮發(fā)油，檸檬烯就是一個(gè)主要監(jiān)測指標(biāo)。本文所建立的氣相色譜測定方法，就是為天然檸檬烯原料的進(jìn)一步開發(fā)利用提供質(zhì)量評價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

氣相色譜儀(7890B，美國Agilent公司)；自動(dòng)進(jìn)樣器(G4513A，美國Agilent公司)；色譜柱 HP-5(J&W GC Columns,30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；BT25S電子分析天平，TE412-L型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；RCTBS025控溫磁力攪拌器(德國IKA公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；電子調(diào)溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司 98-1-B型)；LABOROTA 4000-efficient型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)對照品D-檸檬烯(中國食品藥品檢定研究院)；丙酮、石油醚(60～90 ℃)、無水硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉(均為分析純，北京化工廠)；實(shí)驗(yàn)所用陳皮購于百姓陽光大藥房，其他柑橘類果皮均購于北京市售的果品。

1.3 溶液配制

1.3.1 檸檬烯對照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取檸檬烯176 mg于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解定容，濃度為17.6 mg/mL。準(zhǔn)確吸取此溶液0、0.25、0.5、1.25、2.5、3.75、5、7.5 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容并搖勻。此系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為0、0.44、0.88、2.2、4.4、6.6、8.8、13.2、17.6 mg/mL。

1.3.2 柑橘類揮發(fā)油樣品溶液的制備

分別取不同橘皮各20 g，剪成1 cm×1 cm大小碎片，采用水蒸氣蒸餾方法進(jìn)行提取。根據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，在裝有提取物的燒瓶中同時(shí)加入氯化銨，能夠改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，提高檸檬烯的提取率，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入氯化銨0.7 g。通入水蒸氣連續(xù)蒸餾提取2 h，然后把餾出液倒入分液漏斗中，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，每次用10 mL石油醚萃取3次。合并萃取液，加入適量的無水硫酸鈉干燥30 min后，再減壓過濾除去干燥劑。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把石油醚完全蒸餾出去后，可以得到淡黃色具有柑橘香味的揮發(fā)油。稱質(zhì)量，用丙酮溶解，制成濃度為5 mg/mL的樣品儲備溶液備用。

1.4 氣相色譜條件

色譜柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；氫火焰離子化檢測器(flame inoization detector,FID)；檢測器溫度250 ℃。程序升溫：起始溫度70 ℃，保留16 min，以30 ℃/min升溫至250 ℃，保留1 min。載氣為氮?dú)猓魉? mL/min；進(jìn)樣方式為分流，分流比100∶1；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣量1 μL。

2 結(jié)果

2.1 氣相色譜分離結(jié)果

按“1.4”項(xiàng)下的色譜條件，標(biāo)準(zhǔn)對照品檸檬烯和柑橘樣品的色譜圖見圖1，檸檬烯的出峰時(shí)間為14.374 min。

圖1 檸檬烯對照品和柑橘揮發(fā)油樣品的氣相色譜圖

2.2 線性關(guān)系

把按照“1.3.1”項(xiàng)下配制成的檸檬烯丙酮系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用“1.4”項(xiàng)下的色譜條件，以1 μL的進(jìn)樣量自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜分析測定。以峰面積y為縱坐標(biāo)，對照品檸檬烯的質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)，其線性回歸方程為：y=153.4x-1.223，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 0，圖2為峰面積與濃度關(guān)系圖，這表明檸檬烯濃度在0～17.6 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖2 檸檬烯丙酮溶液峰面積與濃度線性關(guān)系

2.3 精密度試驗(yàn)

按照“1.4”項(xiàng)下的色譜條件，采用自動(dòng)進(jìn)樣器，取對照品檸檬烯溶液(4.4 mg/mL)以1 μL的進(jìn)樣量進(jìn)樣，測定氣相色譜所得峰面積。日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.65%；日間連續(xù)進(jìn)樣6 d，峰面積RSD為1.45%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.3.2”制備的樣品溶液，密封4 ℃下放置，分別于0、1、2、3、4、5、6、7 h后，在設(shè)定的色譜條件下自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，根據(jù)氣相色譜所得峰面積的測定值，7 h內(nèi)的RSD為1.26%，表明供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批按“1.3.2”制備的供試樣品揮發(fā)油6份，在設(shè)定的色譜條件下，以1 μL的進(jìn)樣量連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣。6份供試樣品揮發(fā)油中檸檬烯的濃度和RSD的計(jì)算結(jié)果詳見表1，表明該方法的重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取按“1.3.2”制備的揮發(fā)油供試品樣品9份，分為3組，每組分別平行3份。各組按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2的比例加入已知量的對照品檸檬烯，在設(shè)定的色譜條件下自動(dòng)進(jìn)樣器連續(xù)進(jìn)樣，根據(jù)峰面積的測定值，計(jì)算加樣回收率和RSD值見表2，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 柑橘果皮揮發(fā)油檸檬烯的含量測定

取不同產(chǎn)地的柑橘皮，按照“1.3.2”分別制備樣品溶液，按上述氣相色譜條件測定并計(jì)算檸檬烯在提取揮發(fā)油中的質(zhì)量百分含量，詳見表3。

表3 柑橘果皮揮發(fā)油中檸檬烯的含量結(jié)果

3 討論

檸檬烯一般有三種存在形式，分別是D-檸檬烯、L-檸檬烯和 DL-檸檬烯，在柑橘類果皮揮發(fā)油中主要以D-檸檬烯存在[1,18]。實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法可以有效地提取柑橘類果皮中的揮發(fā)油，本研究所建立的氣相色譜測定方法，就是測定D-檸檬烯在揮發(fā)油中的含量。由于氣相色譜實(shí)驗(yàn)所用溶劑都是易揮發(fā)的，根據(jù)多次試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)時(shí)待測溶液都應(yīng)該密封冷藏保存，才能避免因溶劑的揮發(fā)而產(chǎn)生的影響，同時(shí)也提高了測定的準(zhǔn)確度。從圖1可知，實(shí)驗(yàn)所得到的色譜圖中檸檬烯峰形對稱，無雜質(zhì)峰干擾，分離度好，所以本方法可用于揮發(fā)油中檸檬烯含量的定量測定。

根據(jù)本研究中14種柑橘果皮揮發(fā)油中檸檬烯的測定結(jié)果，可以看出檸檬烯在各種柑橘類果皮中的揮發(fā)油含量差異較大，含量最高的是從新鮮的砂糖橘皮提取到的，檸檬烯含量為89.63%，曬干后為84.44%，這表明砂糖橘皮曬干后檸檬烯的含量有所降低。另外，從本研究表3的結(jié)果中可以看出，我國南方產(chǎn)的砂糖橘、贛南臍橙、小葉桔、南豐蜜桔、沃柑、檸檬果皮的揮發(fā)油中都含有大量的檸檬烯。鑒于檸檬烯在食品[19]、農(nóng)藥[20]、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值[21-22]，也希望本研究所建立的方法能夠?yàn)楦涕兕惞べY源的合理利用以及檸檬烯的質(zhì)控研究奠定基礎(chǔ)。

致謝：本論文獲得“基礎(chǔ)與專業(yè)藥學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(首都醫(yī)科大學(xué))”和“醫(yī)學(xué)化學(xué)與藥學(xué)北京高等學(xué)校示范性校內(nèi)創(chuàng)新實(shí)踐基地(首都醫(yī)科大學(xué))”兩大平臺的支持。