馬婧妤， 劉 莉

(金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心， 浙江 金華 321051)

楊梅(Myricarubra)又稱圣生梅、樹(shù)莓，是一種具有較高藥用和食用價(jià)值的水果[1-4]。全球主產(chǎn)區(qū)是中國(guó)的南方，占世界楊梅產(chǎn)量的98%，楊梅栽培面積約39萬(wàn)hm2，楊梅的年產(chǎn)量約為100萬(wàn)t，國(guó)內(nèi)楊梅的主要產(chǎn)區(qū)在浙江、江蘇、江西、安徽、廣東、廣西和貴州等省。楊梅果樹(shù)病蟲(chóng)害發(fā)生復(fù)雜，成熟后期果蠅、白腐病發(fā)生較重，影響品質(zhì)和產(chǎn)量[5-9]。楊梅用藥過(guò)程中因?yàn)槿狈Π踩盟幖夹g(shù)指導(dǎo)，出現(xiàn)亂用和濫用的現(xiàn)象，特別是利益催動(dòng)下頻繁地使用化學(xué)農(nóng)藥、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等促進(jìn)楊梅的生長(zhǎng)和成熟以及防治楊梅病蟲(chóng)害，從而導(dǎo)致楊梅中農(nóng)藥殘留的安全風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題多，風(fēng)險(xiǎn)隱患突出[10-13]。

國(guó)內(nèi)關(guān)于甲萘威、克百威、吡蟲(chóng)啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯在楊梅中殘留檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。為快速檢測(cè)出楊梅中甲萘威、克百威、吡蟲(chóng)啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯的殘留量，借鑒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定和相關(guān)文獻(xiàn)的前處理方法，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)聯(lián)用快速檢測(cè)楊梅中農(nóng)藥殘留量的方法，以期為楊梅質(zhì)量安全檢測(cè)和農(nóng)藥合理使用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 楊梅 楊梅采購(gòu)于金華市蘭溪市馬澗鎮(zhèn)。

1.1.2 試劑 甲萘威、克百威、吡蟲(chóng)啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯(標(biāo)準(zhǔn)品，100 μg/mL，北京振翔科技有限公司)，無(wú)水硫酸鈉，正己烷均為分析純；乙腈，甲酸為色譜純。實(shí)驗(yàn)用水(一級(jí)水，電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.1.3 儀器 XEVO-TQS#WAC1607超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，CF6RN高速離心機(jī)(日本日立公司)，BSA2202S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)，T25渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)，N-EVAP氮吹儀(Organomation公司)，HY-4調(diào)速多用振蕩器(金壇盛藍(lán))。

1.3色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜 色譜柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A相，5 mmoL乙酸銨-0.1%甲酸水溶液；B相，甲醇；流速：0.45 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為5%。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1液相色譜流動(dòng)相洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜 離子化模式：ES(+)；源溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱氣：空氣10.0 L/min；加熱模塊溫度：600℃；霧化氣：氮?dú)?.0 L/min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)干燥氣：氮?dú)?0.0 L/min；延遲時(shí)間：3 ms；碰撞氣：氬氣0.15 mL/min。6種農(nóng)藥檢測(cè)離子對(duì)、碰撞能參數(shù)見(jiàn)表2。

1.4儲(chǔ)備液的配制和線性相關(guān)性測(cè)試

1.4.1 儲(chǔ)備溶液配制 移取甲萘威、克百威、吡蟲(chóng)啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)各1 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，得4 μg/mL農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取2.5 mL上述溶液至10 mL容量瓶，得1 μg/mL農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.4.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 吸取不同體積的1 μg/mL的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用1.3.2中的流動(dòng)相初始溶液進(jìn)行稀釋，分別得到10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL的不同濃度的溶液。濃度從低到高依次進(jìn)樣測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3次，以離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)及其相應(yīng)的溶液濃度為橫坐標(biāo)，以農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子峰面積(y)及其對(duì)應(yīng)的含量(x，ng/kg)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表26種農(nóng)藥定性定量離子參數(shù)

1.5樣品前處理

1.5.1 試樣制備 按GB/T 8855抽取水果樣品方法，參考GB 2763—2014標(biāo)準(zhǔn)取楊梅放入食品加工器粉碎，去核，制成待測(cè)樣。在18℃條件下保存，備用。

1.5.2 提取 準(zhǔn)確稱取25.00 g(±0.05 g)楊梅試樣放入燒杯中，樣品盡量在燒杯底部，若粘在壁上，加乙腈時(shí)用乙腈進(jìn)行沖洗。加入50.0 mL乙腈，在勻漿機(jī)中高速勻漿2 min后，濾紙過(guò)濾，蒸餾水清洗。濾液收集至裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液40～45 mL。蓋上具塞量筒塞子，劇烈震蕩1 min，打開(kāi)蓋子，在室溫下靜置30 min，乙腈相和水相分層。

1.5.3 凈化 從100 mL具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈提取液于10 mL試管中，置于50℃水浴鍋中氮吹，蒸發(fā)至干，加入2.0 mL二氯甲烷+甲醇(9∶1)溶解，蓋上鋁箔，待凈化。將氨基柱用4 mL V二氯甲烷∶V甲醇為9∶1預(yù)洗。當(dāng)溶劑液面達(dá)到柱吸附層表面時(shí)，立即加入上述待凈化液，用4 mL V二氯甲烷∶V甲醇為9∶1過(guò)柱后，再用同樣條件洗滌氨基柱，合并2次獲取的濾液。

將試管置于水浴35℃中，氮吹至近干，加2 mL甲醇，加入2 mL的超純水，混勻后待其冷卻，再用超純水定容至5.0 mL。在混勻器上混勻后用0.2 μm濾膜過(guò)濾，用液質(zhì)分析。

1.6數(shù)據(jù)處理

按公式計(jì)算超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定楊梅中6種農(nóng)藥殘留量。

(1)

式中：Xi,楊梅樣品中待測(cè)農(nóng)殘的含量，單位為μg/kg；Ci，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的楊梅樣品溶液中待測(cè)農(nóng)殘的濃度，單位ng/mL；V，楊梅樣品溶液定容體積，單位mL；M，楊梅樣品稱樣質(zhì)量，單位g。

在楊梅樣品中添加2個(gè)濃度的6種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2結(jié)果與分析

2.1楊梅樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 提取液 甲萘威、克百威、吡蟲(chóng)啉、苯線磷、氯唑磷、嘧菌酯農(nóng)藥的極性差異較大。乙腈對(duì)不同極性的物質(zhì)均有較好溶解度，可以作為楊梅中農(nóng)藥殘留的提取劑。而且，乙腈再提取含有大量色素的樣品是可以有效降低色素物質(zhì)的干擾，大量試驗(yàn)表明乙腈適合多組分同時(shí)檢測(cè)[14]。楊梅溶液呈現(xiàn)酸性，在乙腈中加入1%乙酸，可模擬楊梅果實(shí)的酸性環(huán)境，避免因?yàn)閜H變化引起楊梅生物堿性合物的變性。

2.1.2 凈化方式 楊梅樣品在凈化過(guò)程中，有2次氮吹，且2次氮吹的溫度和最后的氮吹形態(tài)均不同。第1次凈化氮吹是濃縮樣品，將樣品中的乙腈吹除，因此氮吹后樣品需要盡可能的干燥，減少乙腈對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。溫度設(shè)在50℃，溫度過(guò)高將導(dǎo)致樣品中低沸點(diǎn)農(nóng)藥損失。溫度低于50℃，氮吹的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。第2次凈化氮吹的目的是除去樣品溶液中的二氯甲烷。二氯甲烷的沸點(diǎn)比較低，35℃條件下可以完成氮吹。氮吹溫度過(guò)高，溶解在二氯甲烷中的農(nóng)藥會(huì)隨二氯甲烷蒸發(fā)，導(dǎo)致回收率偏低。溶液中若有二氯甲烷將導(dǎo)致檢測(cè)樣品分層，渾濁，影響測(cè)量的結(jié)果。樣品溶液經(jīng)過(guò)氮吹凈化，體積在1 mL以下，可以認(rèn)為二氯甲烷完全去除。因?yàn)榧状嫉姆悬c(diǎn)遠(yuǎn)高于二氯甲烷，二氯甲烷優(yōu)先與甲醇被蒸發(fā)。

2.2檢測(cè)條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件 采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙酸銨與甲酸。在正離子模式下，甲酸提供H+，有利于形成[M+H]+，可以提高檢測(cè)的靈敏度；乙酸銨有助于提高農(nóng)藥在保留時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性以及保證峰形對(duì)稱。通過(guò)優(yōu)化梯度、流速等試驗(yàn)條件，6種農(nóng)藥在10 min內(nèi)全部出峰(圖1)。

圖16種農(nóng)藥殘留的總離子色譜圖

2.2.2 質(zhì)譜條件 在ES+模式下分別對(duì)6種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，確定6種農(nóng)藥分子離子峰[M+H]+，調(diào)節(jié)離子源電壓、錐孔電壓和碰撞氣出口流量等；以農(nóng)藥分子離子峰作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，當(dāng)母離子的響應(yīng)強(qiáng)度是子離子響應(yīng)強(qiáng)度的25%～30%為最佳調(diào)節(jié)碰撞能量參數(shù)，在質(zhì)譜圖中選擇2～3個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的子離子作為定性離子和定量離子，其中豐度最強(qiáng)的子離子作為定量離子，再進(jìn)行錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。質(zhì)譜參數(shù)確定后，取50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化后的色譜條件下逐個(gè)進(jìn)行微調(diào)優(yōu)化，使6種農(nóng)藥的靈敏度、峰形達(dá)到最佳。

2.3檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

2.3.1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限 由表3可見(jiàn)，6種農(nóng)藥在10～80 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.997 156～0.999 51；以特征定量離子對(duì)色譜峰3倍的信噪比(S/N=3)確立方法的檢出限為0.4～300 ng/kg，以特征定量離子對(duì)色譜峰10倍的信噪比確立方法的定量限為1～1 092 ng/kg，能夠滿足楊梅中6種農(nóng)藥殘留的定量分析要求。

表36種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.3.2 方法的精密度及回收率 由表4可知，楊梅中6種農(nóng)藥添加樣品的回收率為87.23%～97.73%，回收率最低的是嘧菌酯，回收率偏低的原因，可能由于100 ng高濃度樣品基質(zhì)干擾影響。批內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.01%～6.24%。

2.4基質(zhì)效應(yīng)

在農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，當(dāng)樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，樣品集中可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾，導(dǎo)致目標(biāo)物準(zhǔn)確定量變得困難。對(duì)樣品采用正確的前處理方法可有效降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[15]。試驗(yàn)采用不含檢測(cè)農(nóng)藥的空白楊梅樣品提取液配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正回收率，并采用內(nèi)標(biāo)法定量，盡可能地降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響。

表4楊梅樣品中6種農(nóng)藥的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差 %

3小結(jié)

建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測(cè)定楊梅中6種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法，方法的檢出限和定量限分別為0.4～300 ng/kg和1～1 092 ng/kg，測(cè)定6種農(nóng)藥在10～80 ng/mL時(shí)線性關(guān)系良好(r>0.997156)，平均回收率范圍為87.23～97.73%%(n=6)。該方法相比與普通液相色譜法，定性定量準(zhǔn)確，檢測(cè)速度提升，分離時(shí)間縮短，方法的靈敏度和分離度以及重現(xiàn)性較好，穩(wěn)定性高，滿足楊梅中農(nóng)藥殘留分析的檢測(cè)要求，同時(shí)溶劑用量大為減少，分析成本降低，檢測(cè)效率得到提升。