張程涵， 趙會納， 余 婧， 余世洲， 許本波， 雷 波*

(1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 荊州 434025； 2.貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室， 貴州 貴陽 550081)

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，煙葉各種化學(xué)成分的含量及其比例影響煙氣質(zhì)量[1-2]。煙株從土壤或肥料中吸收的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮優(yōu)先供應(yīng)煙株的頂葉，再緩慢向下運輸[3]。生物堿、蛋白質(zhì)、氨基酸等是煙葉中的主要含氮化合物[4-5]，對煙株的生長發(fā)育有重要的生理功能，如氨基酸參與構(gòu)成酶、激素，調(diào)控能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]，可以平衡氮含量[6]，脯氨酸是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高煙株的抗逆性[7-8]。此外，含氮化合物是衡量煙葉品質(zhì)的最重要指標(biāo)[9]，煙堿影響煙氣的勁頭和濃度，決定煙氣的生理強度[4]；蛋白質(zhì)會產(chǎn)生類似羽毛燃燒的臭味[10]；氨基酸可以與還原糖在煙葉烘烤、醇化等過程發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成多種香氣物質(zhì)[11]。因此，煙葉中含氮化合物差異對煙株生長和品質(zhì)評價有重要意義。在成熟期煙株光合能力減弱、分解能力增強，化學(xué)成分趨于協(xié)調(diào)，是煙株生長發(fā)育過程中重要時期，而含氮物質(zhì)含量受遺傳、栽培措施、氣候等多種因素的影響[12-16]，其中品種是彰顯品質(zhì)特色的關(guān)鍵因子[17]。近年來，不少學(xué)者采用偏最小二乘法結(jié)合均值差異分析判別篩選煙草中差異代謝標(biāo)記物[18-21]。K326和Y87是我國目前各煙區(qū)的主要種植品種，其煙葉質(zhì)量對我國卷煙工業(yè)的效益有一定影響。因此，掌握K326和Y87成熟期煙葉的含氮物質(zhì)差異，為其精準(zhǔn)合理利用與種植調(diào)控含氮物質(zhì)含量提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1種植地概況

烤煙品種K326和Y87種植于貴州省貴陽市清鎮(zhèn)市盧狄村。施基肥前種植地土壤全氮0.172%、水解氮131.89 mg/kg、全磷0.81 g/kg、有效磷12.48 mg/kg、全鉀27.58 g/kg、速效鉀241.00 mg/kg、有機質(zhì)34.15 g/kg、pH為4.63，土壤養(yǎng)分含量均在合理范圍，適合種植烤煙。

1.2種植方法

烤煙品種K326和Y87各種植3個小區(qū)，各小區(qū)種植6行、每行20株、共120株。移栽行距110 cm，株距50 cm。施N量為90 kg/hm2，分2次施入。其中：基施量為63 kg/hm2，用貴州科泰金福肥業(yè)有限公司生產(chǎn)的N∶P∶K=12∶12∶24的專用肥，在起壟時條施；追施量為27 kg/hm2，用貴州科泰金福肥業(yè)有限公司生產(chǎn)的N∶P∶K=15∶0∶30的專用肥，在移栽后35 d窩施。打頂留葉數(shù)為16片/株。其他田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙栽培技術(shù)。

1.3煙葉樣品采集

選擇田間發(fā)育良好的煙株，單株掛牌，在成熟期采集每個小區(qū)的第8葉位煙葉樣品，去主脈后裝進(jìn)凍存管立即放入液氮帶回實驗室，將樣品進(jìn)行真空冷凍粉碎后測定其含氮化合物含量。

1.4測定項目

總糖、還原糖、總氮、蛋白質(zhì)含量參照文獻(xiàn)[22-24]測定的方法，可溶性蛋白質(zhì)用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的總蛋白測定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)測定，生物堿參照文獻(xiàn)[25]測定，氨基酸、多胺和銨離子參照文獻(xiàn)[26]的方法測定。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用數(shù)據(jù)分析軟件SIMCA13.0對K326和Y87煙葉含氮化合物數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0的獨立樣本t檢驗對2個品種進(jìn)行含氮化合物均值比較，并將分析結(jié)果在Excel進(jìn)行整理。

偏最小二乘法分析(PLS-DA)中，VIP值是衡量變量對分類貢獻(xiàn)大小的重要指標(biāo)，VIP值越大對分類貢獻(xiàn)越大，一般篩選VIP>1.0且均值比較中存在0.05水平或0.01水平差異的代謝物質(zhì)作為差異代謝物質(zhì)，試驗采用此方法進(jìn)行差異含氮物質(zhì)篩選。

2結(jié)果與分析

2.1K326和Y87成熟期中部葉含氮化合物種類

由表1可見，主栽品種K326和Y87煙葉共36種含氮化合物，主要包括生物堿(煙堿、降煙堿、新煙草堿、假木賊堿)、總氮、蛋白質(zhì)、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺等)、多胺(酪胺、腐胺、苯乙胺等)及銨離子。

表1K326和Y87成熟期中部葉測定的含氮物質(zhì)

2.2K326和Y87成熟期中部葉的含氮物質(zhì)差異

由圖1可見，K326和Y87煙葉含氮物質(zhì)差異明顯，分類明顯。在主成分散點圖上可以明顯的分為2類，一類為K326，另一類為Y87，可篩選K326和Y87煙葉的差異含氮物質(zhì)。

由圖2可見，對K326和Y87煙葉分類貢獻(xiàn)較大(VIP>1.0)的代謝產(chǎn)物有瓜基丁胺、天冬氨酸、高精米、谷氨酸、酪胺、異亮氨酸、精氨酸、蛋白質(zhì)、亞精胺、天門冬酰胺、蘇氨酸、γ-氨基丁酸、總氮、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸。

圖1K326和Y87煙葉含氮化合物的主成分散點分布

圖2K326和Y87煙葉含氮化合物的載荷圖分布

2.3K326和Y87成熟期中部葉含氮物質(zhì)差異的t檢驗

由表2可知，總氮、蛋白質(zhì)、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸在K326和Y87煙葉間差異不顯著，因此在差異物質(zhì)篩選中剔除。綜合偏最小二乘法判別分析(VIP>1.0)和t檢驗共篩選了K326和Y87煙葉的差異含氮物質(zhì)有13種，分別為γ-氨基丁酸、高精米、胍基丁胺、精氨酸、酪氨酸、酪胺、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、纈氨酸、亞精胺、異亮氨酸。

表2K326和Y87煙葉中含氮化合物及其t檢驗

K326煙葉的1種含氮物質(zhì)(瓜基丁胺)含量極顯著低于Y87，3種含氮物質(zhì)(高精米、酪胺、異亮氨酸)含量極顯著的高于Y87，9種含氮物質(zhì)(γ-氨基丁酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、纈氨酸、亞精胺)含量顯著高于Y87。

3小結(jié)

試驗發(fā)現(xiàn)，K326和Y87成熟期中部煙葉的差異含氮物質(zhì)主要是氨基酸，共篩選出13種差異氨基酸，其中K326煙葉的1種含氮物質(zhì)(瓜基丁胺)含量極顯著低于Y87，3種含氮物質(zhì)(高精米、酪胺、異亮氨酸)含量極顯著的高于Y87，9種含氮物質(zhì)(γ-氨基丁酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、纈氨酸、亞精胺)含量顯著高于Y87，但K326和Y87煙葉的總氮、蛋白質(zhì)、生物堿含量差異均不顯著?？赡苁桥c2個品種本身的遺傳特性、自身氮素代謝及氨基酸的合成和代謝有關(guān)。因試驗為一年單點試驗，可能還存在一定的局限性，在下一步的研究中擬結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，探討K326和Y87煙葉的氨基酸代謝差異及差異原因。