黃黎芳 武志江 梁桂東 陸貴鋒 黃鳳珠 劉朝安 鄧海燕

摘 ?要：火龍果為仙人掌科量天尺屬和蛇鞭柱屬植物，不同類型火龍果種質(zhì)的染色體倍性尚不明確。為明確所收集的種質(zhì)資源以及創(chuàng)制的新材料的染色體倍性，利用流式細胞技術對29份火龍果材料進行了倍性鑒定。結果顯示，供試的18份種質(zhì)資源中共鑒定出二倍體火龍果14份，四倍體4份，無三倍體材料。通過不同倍性親本雜交和秋水仙素誘變所創(chuàng)制的8份后代材料經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)有二倍體材料1份，三倍體材料3份，四倍體材料4份，這表明火龍果屬間雜交和化學誘變可獲得多倍體材料。研究結果對火龍果資源的遺傳學評價以及開展倍性雜交育種提供重要的參考依據(jù)。

關鍵詞：流式細胞術;火龍果;種質(zhì)資源;染色體;倍性分析中圖分類號：S667??????文獻標識碼：A

Ploidy Determination of 29 Pitaya Germplasms Using Flow Cytometry

HUANG Lifang， WU Zhijiang， LIANG Guidong， LU Guifeng， HUANG Fengzhu， LIU Chaoan，DENG Haiyan^*

Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Pitaya which belongs to the cactus family includes two genus，HylocereusandSeleniereus， the ploidy levels of different pitaya germplasms are still not clear. In order to clarify the ploidy of germplasm resources and the hybrids or mutants， the ploidy of 29 pitaya materials were identified by flow cytometry. 14 of 18 germplasm materials were diploid and others were tetraploid while no triploids were available. The 8 interploid hybrids and colchicine-induced mutants were identified as 3 triploids， 4 tetraploids and 1 diploid， which showed that polyploid materials could be obtained by intergeneric hybridization and chemical mutagenesis of pitaya. The results would provide an important reference basis for genetic evaluation and ploidy cross breeding of pitaya resources.

Keywords： flow cytometry; pitaya; germplasm resources; chromosome; ploidy analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.008

火龍果為仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）和蛇鞭柱屬（Seleniereus）攀援性多年生植物，原產(chǎn)于中南美洲熱帶地區(qū)，因其果實豐富的營養(yǎng)價值和功能作用廣受消費者歡迎。自20世紀90年代引入中國大陸以來，在我國南亞熱帶地區(qū)廣泛種植。火龍果種質(zhì)資源豐富，在自然界中主要存在二倍體（2n=22）和四倍體（2n=44）2種類型^[1-2]。Tel-Zur等^[3]報道了火龍果量天尺屬為二倍體（2n=22），蛇鞭柱屬也是二倍體（2n=22），有刺黃皮白肉種Hylocereus?megalanthus屬于異源四倍體（2n=4x=44），來源于Hylocereus和Seleniereus屬的自然雜交。劉順枝等^[4-5]利用優(yōu)化的染色體制片技術開展了火龍果植物染色體觀察研究，并進行了染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)白肉火龍果（Hylocereus undatus）的染色體數(shù)目為2n=2x=22，紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）染色體數(shù)目為2n=2x=22。因火龍果植物包含2個屬以及其屬間雜交種，通過種質(zhì)資源收集得到的除原生種外，還有許多育種中間材料，其倍性類型不明確。不同倍體間雜交是火龍果育種經(jīng)常采用的方法之一，這使得雜交后代植株的倍性水平復雜多樣，因此鑒別火龍果種質(zhì)資源及創(chuàng)制的后代植株的倍性，在火龍果育種實踐中非常必要。

染色體計數(shù)法和染色體核型分析可以精確鑒定火龍果倍性，但其操作耗時，不適宜大規(guī)模鑒定倍性。流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細胞儀進行分析、分選的技術，采用光學系統(tǒng)對高速流動的單細胞懸浮液進行多參數(shù)測量和信號處理得到的DNA含量分布曲線，可以直接觀測植物倍性。近年來，流式細胞儀檢測已廣泛應用于細胞學、遺傳學、細胞周期分析及植物基因組大小估算等研究中。迄今在蘋果^[6]、獼猴桃^[7]、草莓^[8]、越橘^[9]、梨^[10]和荔枝^[11]等果樹上均證實了流式細胞光度術鑒定植株染色體倍性的可靠性。本研究利用流式細胞技術對收集的火龍果不同種質(zhì)資源類型和創(chuàng)制的后代植株進行染色體倍性鑒定研究，以期挖掘更多的多倍體種質(zhì)，為火龍果種質(zhì)資源的創(chuàng)新和開發(fā)利用提供參考。

1??材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?供試種質(zhì)??供試樣品共29個（表1），采集于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南寧火龍果種質(zhì)資源圃。材料來源于中國臺灣、越南、中美洲等火龍果種植地區(qū)。試驗于2019年11月采集植株的幼嫩肉質(zhì)莖尖供染色體倍性分析。

1.1.2 ?試劑??（1）解離緩沖液（Tris·MgCl₂ 緩沖液）：200?mmol/L Tris，4?mmol/L MgCl₂，0.5%（V/V）TritionX-100;用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.5，0.22?mm濾膜過濾除菌，4?℃保存。（2）染色緩沖液：解離液緩沖液中加入20?mg/L碘化丙啶（PI）和20 mg/L的RNA酶，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 ?儀器與設備??流式細胞儀型號為美國BD（Becton， Dickinson and Company）公司生產(chǎn)的BD660517 C6-Plus。染色體含量的分布圖像由流式細胞儀自動測定，相關參數(shù)的調(diào)控參照儀器說明。光源由波長為488?nm氬離子激發(fā)，染色的DNA分子促發(fā)熒光，測定其熒光強度，與測定裝置相連的計算機分析軟件即可對熒光強度進行分析。本次實驗所有測試樣品的細胞核DNA含量是以二倍體對照為標準的相對值，每次檢測至少收集5000個細胞顆粒。

1.2方法

（1）稱取約50 mg的葉片組織，蒸餾水洗凈表面塵土，濾紙吸干后放入預冷的培養(yǎng)皿內(nèi)，加預冷的解離液1?mL解離緩沖液;用鋒利的刀片一次性快速切碎，整個過程材料需浸沒在解離液中，以便更好地游離細胞核。（2）吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液，用300目的濾膜過濾至1.5 mL離心管中，15?000?r/min離心15～20 s，棄上清。（3）加200?μL預冷的染色緩沖液重懸，37?℃孵育15?min，上機檢測。

2??結果與分析

2.1流式細胞倍性檢測

以二倍體紅皮紅肉火龍果‘金都1號為對照，流式細胞儀測得二倍體品種染色體的峰值熒光強度為187×10³，表現(xiàn)為較好的單峰;三倍體品種DNA相對含量是二倍體的1.5倍，呈現(xiàn)為1.5倍二倍體的單峰;四倍體品種染色體相對含量是二倍體的2倍，呈現(xiàn)為2倍二倍體的單峰（圖1）。

2.2不同類型火龍果種質(zhì)資源的染色體倍性

經(jīng)流式細胞儀檢測收集的18份不同類型的火龍果種質(zhì)材料染色體倍性，從表2可見，其中量天尺屬紅皮白肉品種‘越南白肉、青皮白肉品種‘青龍和無刺黃皮白肉品種‘無刺黃龍均鑒定為二倍體，與對照‘霸王花倍性一致。鑒定發(fā)現(xiàn)4份四倍體種質(zhì)材料分別為‘哥倫比亞黃龍‘燕窩果‘美國糖龍‘紅麒麟。其中‘燕窩果來源于‘哥倫比亞黃龍后代，表現(xiàn)出四倍體的特征;‘美國糖龍和‘紅麒麟為量天尺屬紅皮紅肉品種二倍體與‘哥倫比亞黃龍四倍體的雜交后代，也表現(xiàn)出四倍體的特征。其余7個量天尺屬紅皮紅肉品種經(jīng)鑒定均為二倍體。蛇鞭柱屬的‘黑龍和屬間雜交種‘白水晶‘紅肉燕窩果‘小葉紅水晶經(jīng)鑒定為二倍體材料。未發(fā)現(xiàn)有三倍體種質(zhì)材料。

2.3 雜交后代及誘變材料的染色體倍性水平

本課題組前期利用2個S. megalanthus種質(zhì)A13（4x）和C59（4x）分別與H. undatus種質(zhì)MB（2x）雜交，獲得后代A13-MB、C59-MB1和C59-MB2。經(jīng)流式細胞術檢測A13-MB為四倍體，C59-MB1和C59-MB2為三倍體植株（表3），說明火龍果四倍體與二倍體屬間雜交可產(chǎn)生一定比例的三倍體和四倍體。而C59自交產(chǎn)生的F₁代植株C59+經(jīng)鑒定為四倍體，該結果與四倍體自交后代倍性預期一致。育種中間材料C51經(jīng)鑒定為三倍體，三倍體C51與二倍體MB雜交F₁代未發(fā)現(xiàn)多倍體，僅產(chǎn)生二倍體后代C51-MB。流式細胞儀測得的三倍體和四倍體材料結果基本符合預期。

YD-1、YD-2為本課題組前期利用二倍體材料H. polyrhizus種子經(jīng)秋水仙素加倍后產(chǎn)生的誘變植株，其細胞核DNA含量直方圖上出現(xiàn)單一的波峰，且其峰熒光值與對照相差近一倍，說明二者染色體數(shù)目加倍，其植株倍性預測為四倍體。前期形態(tài)學觀察也表現(xiàn)出子葉顯著增大增厚，植株健壯，生長勢強等特征。誘變植株未發(fā)現(xiàn)存在細胞核含量成倍數(shù)性差異的兩群細胞，說明無倍性嵌合體出現(xiàn)。

3??討論

通過形態(tài)學鑒定植株倍性，是早期研究者最常用的方法?；瘕埞谋扼w材料是異源四倍體，在植株形態(tài)上與其他二倍體植株有較大差異，但僅通過形態(tài)學觀察不能精準判斷火龍果的倍性，尤其在幼苗期，不同倍性材料形態(tài)學差異并不顯著。利用流式細胞術能在幼苗期鑒定植株倍性，將為高效準確篩選雜交育種材料提供便利。本研究中，測試的18份種質(zhì)資源僅‘越南白肉經(jīng)劉順枝等^[4]利用染色體制片法鑒定為二倍體，‘哥倫比亞黃龍經(jīng)Tel-Zur等^[12]利用流式細胞術鑒定為四倍體，其余16份材料均為本研究首次分析確定其染色體倍性。經(jīng)測試，‘越南白肉和‘哥倫比亞黃龍染色體倍性與前人報道一致。其余16份種質(zhì)資源按不同種屬類型，其倍性鑒定結果與Tel-Zur等^[12]報道的相應類型的材料倍性一致，量天尺屬的紅皮白肉、青皮白肉和無刺黃皮白肉品種均被認為是二倍體，而量天尺屬的紅皮紅肉、蛇鞭柱屬的紅皮紅肉和紅皮白肉種也均為二倍體。而形態(tài)學上與S. megalanrus具有類似特征的帶刺黃皮白肉及其后代、帶刺橘皮紅肉品種均為四倍體。18份種質(zhì)資源材料中未檢測到三倍體植株，可能火龍果天然雜交出現(xiàn)三倍體的幾率較低。

火龍果的刺黃皮白肉四倍體種H. megalanrus既具有量天尺屬類似的三棱柱狀肉質(zhì)莖，又像蛇鞭柱屬一般具有帶刺的果實，果實具有濃郁的風味，被用于培育優(yōu)良的多倍體雜交種，以期獲得具更優(yōu)良性狀如更大的果實、果皮不帶刺和更高的產(chǎn)量的品種。根據(jù)這些育種目標，研究人員進行了屬間雜交和化學誘變等多倍體育種，可產(chǎn)生性狀改良的二倍體和多倍體后代應用于育種實踐中^[13]。本研究應用流式細胞儀測定的11個雜交親本和后代以及誘變植株中，親本A13和C59為四倍體，MB為二倍體;創(chuàng)制的種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)1個二倍體C51-MB;3個三倍體分別是C59-MB1、C59-MB2、C51;4個四倍體分別是A13-MB、C59+、YD-1、YD-2;倍性突變材料未見有二倍體和四倍體的嵌合體或混倍體出現(xiàn)。本研究中Hylocereus和Seleniereus的屬間雜交可獲得一定比例的二倍體、三倍體和四倍體，但未像前人報道一樣獲得五倍體和六倍體^[14]，可能與本試驗所用雜交后代材料較少有關。而三倍體C51作為母本經(jīng)與二倍體父本MB（H. undatus）雜交得出二倍體后代C51-MB，說明該三倍體是部分可育的，至少可產(chǎn)生具有功能的雌配子，在與花粉供體雜交的情況下最終形成可存活的后代。Tel-Zur等^[15]推測異源三倍體產(chǎn)生功能性雌雄配子的比例較高是由于染色體平衡分離的結果。本試驗僅停留在對火龍果植物進行染色體倍性鑒定上，而基于火龍果植物細胞學方面的研究較少，下一步將繼續(xù)開展火龍果多倍體的核型分析、氣孔大小和密度、可育性等方面研究，為火龍果育種提供更多細胞學支撐。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)同一倍性內(nèi)不同品種火龍果細胞核DNA含量差異不顯著，倍性間細胞核DNA含量成倍數(shù)性差異，進一步證明利用流式細胞光度術測定細胞核DNA相對含量來鑒定火龍果倍性是可行的。與利用染色體計數(shù)法相比，流式細胞光度術測定核DNA含量試樣處理簡單，試材用量?。?0 mg左右），測量較準確、快速、重復性好，適用于樣本較多的植物倍性檢測分析，對于多倍體后代的早期鑒定具有較大應用價值，但是缺陷是不能獲得更為詳細的染色體信息。

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責任編輯：沈德發(fā)