馬依莎 王文燕 譚艷平 劉新瓊 黎艷艷 姚凱龍 徐鑫 王春臺

摘 要：為減輕傳統(tǒng)有性雜交驗證遺傳基本規(guī)律的工作量以及把傳統(tǒng)雜交試驗與分子遺傳學(xué)相結(jié)合，利用分子標(biāo)記和性狀共同驗證分離及連鎖遺傳規(guī)律，從http：//flybase.org/下載果蠅（Drosophila melanogaster）Chr.2R DNA序列并設(shè)計引物，篩選長翅和殘翅（Vg/vg）果蠅之間多態(tài)性連鎖PCR標(biāo)記，獲得了2個與Vg/vg緊密連鎖的側(cè)翼PCR標(biāo)記R15和R24，對長翅和殘翅雜交后自交得到的F2代個體進行翅型觀察統(tǒng)計的同時進行PCR分析。結(jié)果表明：自交F2代中Vg/vg、R15/r15分離符合3∶1的分離比，R24/r24的分離符合1∶2∶1的分離比;Vg/vg與R15/r15的交換值為7.24%～8.42%，Vg/vg與R24/r24的交換值為22.82%～23.8%。

關(guān)鍵詞：果蠅;PCR標(biāo)記;雜交;遺傳規(guī)律驗證

中圖分類號 Q963文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）08-0020-06

Abstract： To simplify the workload of traditional sexual hybridization to verify the three basic laws of genetics and combine traditional hybridization experiments with molecular genetics， molecular markers and characteristics are used to jointly verify the laws. The DNA sequence of Drosophila melanogaster Chr.2R was downloaded from http：//flybase.org/ and the PCR primers were designed to screen the polymorphism between long and residual wing （Vg/vg） fruit flies and 2 flank linkage PCR markers R15 and R24 with Vg/vg were obtained. The PCR analysis was carried out at the same time as the wing observation statistics of F2 generation individuals obtained by self-interbreeding after long-wing and residual wing hybridization. The segregation of Vg/vg、R15/r15 was according with 3∶1， and R24/r24 was according with 1∶2∶1 in F2 population. The cross-over value between Vg/vg and R15/r15 is 7.24%～8.42%，Vg/vg and R24/r24 is 22.82%～23.8%。

Key words： Drosophila melanogaster; PCR Marker; Hybridization; Verifying of Genetics Laws

果蠅（Drosophila melanogaster）是生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中最重要的生物材料之一，早在2000年就完成全基因組序列測定[1]，并在基因組學(xué)和基因功能研究等領(lǐng)域取得了許多輝煌成就。作為模式動物的果蠅具有諸多優(yōu)勢：（1）易飼養(yǎng)。黑腹果蠅的飼養(yǎng)只需要很小的空間和設(shè)備，飼料成本低，非常適合實驗室飼養(yǎng);（2）生長周期短。包括卵期、幼蟲期、蛹期、成蟲形成與產(chǎn)卵，在25℃條件下10d左右即可完成;（3）高繁殖。雌蟲每天產(chǎn)卵多達100枚，一生約產(chǎn)2000枚卵;（4）雌雄易分辨。雌雄差異明顯，未交配的雌蟲容易辨識，方便后續(xù)雜交試驗[2]。

果蠅飼養(yǎng)容易、繁殖快的特點保證了實驗材料的供應(yīng)。自從遺傳學(xué)家摩爾根在1908年把果蠅引入遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，此后果蠅就成為經(jīng)典遺傳學(xué)的“主角”，利用果蠅已經(jīng)產(chǎn)出5個諾貝爾獎。摩爾根[3]發(fā)現(xiàn)了果蠅白眼突變的性連鎖遺傳，提出了基因在染色體上直線排列以及連鎖交換定律，因此在1933年被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎;“果蠅的突變大師”穆勒[4]證明X射線能使果蠅的突變率提高150倍，因而成為1946年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者;愛德華·路易斯、克里斯汀·紐斯林-沃爾哈德和艾瑞克·威斯喬斯[5]闡明了胚胎發(fā)育的遺傳規(guī)律，為研究人類的胚胎發(fā)育奠定了重要理論基礎(chǔ)而獲得1995年諾貝爾獎;Hoffmann等[6]在果蠅體內(nèi)分離出Toll基因，并發(fā)現(xiàn)該基因所表達的蛋白質(zhì)作為受體，能特異識別某些入侵的細(xì)菌或真菌，從而激活機體的先天免疫反應(yīng)，為傳染病、癌癥以及炎癥的防治開辟了新路徑，獲得2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎;美國遺傳學(xué)家Jeffrey C. Hall、Michael Rosbash和Michael W. Young[7]利用果蠅作為模式動物發(fā)現(xiàn)了控制生物鐘的分子機制，獲得2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。截至2020年12月22日17：00，以“Drosophila”為關(guān)鍵詞，在Pubmed上可檢索到110900篇學(xué)術(shù)論文。果蠅基因組學(xué)和功能基因研究的飛速發(fā)展為生物醫(yī)學(xué)專業(yè)等基礎(chǔ)與應(yīng)用科學(xué)提供了越來越多的幫助。

果蠅是經(jīng)典遺傳學(xué)和現(xiàn)代遺傳學(xué)研究的通用材料，果蠅的單雙因子、伴性及連鎖遺傳試驗是傳統(tǒng)而經(jīng)典的遺傳學(xué)實驗之一。通過果蠅的雜交實驗，可以掌握果蠅的雜交技術(shù)，并學(xué)會記錄交配結(jié)果和掌握統(tǒng)計處理方法;認(rèn)識伴性遺傳的正、反交差別，掌握伴性遺傳的特點;掌握繪制遺傳學(xué)圖的原理和方法，學(xué)會處理實驗數(shù)據(jù)，加深對重組值、遺傳學(xué)圖、雙交換值、并發(fā)率和干涉等概念的理解，并驗證與加深理解3個遺傳規(guī)律。但傳統(tǒng)的雜交實驗要達到上述目標(biāo)，需要通過3個性狀差異的親本進行雜交和測交才能完成，不僅工作量大（雜交和測交都必須分離處女蠅），而且對實驗材料要求嚴(yán)格，經(jīng)常受三隱性材料的限制而不能完成三點測交，因此不能進行雙交換值、并發(fā)率和干涉等實驗，且知識點僅停留在經(jīng)典遺傳學(xué)水平[8]。為此，筆者首先篩選殘翅（vg）和長翅（Vg）果蠅之間具有多態(tài)性且與殘翅/長翅連鎖的PCR標(biāo)記，對殘翅和長翅雜交得到F2代個體進行翅型觀察統(tǒng)計的同時進行PCR分析，計算標(biāo)記與殘翅/長翅的交換值。通過1個雜交（長翅與殘翅）和自交，結(jié)合與翅型連鎖的分子標(biāo)記，完成遺傳學(xué)基本規(guī)律的驗證，同時增加了動物DNA提取、分子標(biāo)記鑒定2個知識點，實現(xiàn)經(jīng)典實驗的分子化和分子實驗的經(jīng)典化。

1 材料與方法

1.1 供試材料 殘翅和長翅果蠅由中南民族大學(xué)實驗教學(xué)與實驗室管理中心繁殖保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 從http：//flybase.org/數(shù)據(jù)庫下載果蠅2R的DNA序列，利用PCR引物設(shè)計軟件在距vg基因兩側(cè)各10cm左右共設(shè)計30對特異引物，由昆泰銳（武漢）生物有限責(zé)任公司合成。

1.2.2 果蠅雜交 殘翅（雌）與長翅（雄）及殘翅（雄）與長翅（雌），獲得F1及F2，觀察統(tǒng)計F1及F2的翅型及數(shù)目，同時收集親本、F1及F2的果蠅個體，并單獨保存于-20℃條件下。

1.2.3 親本果蠅基因組DNA提取 參照徐書華和曾慶韜[9]采用的方法加以改進簡化。取6只冷凍的果蠅，放入1.5mL離心管中，加入預(yù)熱的消化緩沖液30?L（100mmol/L Tris-HCl，25mmol/L EDTA，1.5mol/L NaCl，3%CTAB），用200?L Tip槍頭迅速搗碎;補加預(yù)熱的消化緩沖液400?L，混勻，置65℃溫浴30min，每10min搖蕩1次，使樣品被充分消化;取出離心管加入400?L氯仿和異戊醇（24∶1）的混合物，蓋緊管蓋，上下顛倒充分混勻，抽提樣品5min，12000rpm離心5min;小心吸取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入400?L異丙醇，輕輕混勻3min，此時可見白色線團狀物質(zhì)出現(xiàn);14000rpm離心10min，讓線團狀物質(zhì)沉到管底或管壁，小心倒出液體;用400?L 70%的乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min，倒掉乙醇，倒置晾干至乙醇?xì)馕断?，沉淀?0?L TE緩沖液溶解;取5?L溶解好的DNA加1?L上樣緩沖液進行瓊脂糖（1%）凝膠電泳，以2?L DNA Marker作參照，估算DNA濃度。100V電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。根據(jù)檢測結(jié)果將DNA稀釋至10ng/?L，用于PCR。

1.2.4 多態(tài)性連鎖引物的篩選 以殘翅與長翅果蠅基因組DNA為模板，鑒定40對引物的可擴增性和遺傳多態(tài)性。10?L PCR體系含PCR buffer 1?L、dNTP 1?L、Primer F 和Primer R各 0.2?L、模板DNA 1?L、Taq E 0.1?L、ddH2O 6.5?L。反應(yīng)程序為95℃變性4min，94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、35個循環(huán)，72℃延伸8min。制備1.5%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物中加1?L上樣緩沖液后點樣，100V電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.5 單果蠅微量基因組DNA提取及檢測 取冷凍的單果蠅放入0.5mL離心管中，加入消化緩沖液20?L，用200?L Tip槍頭迅速搗碎。補加消化緩沖液150?L，混勻。其余步驟同1.2.3。沉淀用20?L TE緩沖液溶解。電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度后用于PCR。

1.2.6 F2代個體PCR標(biāo)記分析 分別以F2的單個果蠅基因組DNA為模板，以獲得的多態(tài)性引物進行擴增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同上。同一個體的2個PCR反應(yīng)產(chǎn)物點在同一點樣孔電泳，確定每個F2個體的基因型。

1.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)雜交后代的表現(xiàn)型及PCR標(biāo)記結(jié)果，先用χ2檢驗各性狀與各標(biāo)記是否符合分離規(guī)律、兩兩之間是否符合自由組合規(guī)律;對于不符合自由組合規(guī)律的計算交換值、雙交換值等。

2 結(jié)果與分析

2.1 簡易法提取DNA質(zhì)量 取簡易法提取的果蠅基因組DNA 2?L進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖1可知，主帶明顯，可用于PCR分析。

2.2 多態(tài)性連鎖PCR引物 從http：//flybase.org/數(shù)據(jù)庫下載果蠅2R的DNA序列后利用PCR引物設(shè)計軟件在距vg基因（2R 12884632-12899385 bp）兩側(cè)各10cm左右共設(shè)計30對特異引物，篩選長翅與殘翅之間的多態(tài)性，只獲得2對多態(tài)性引物（圖2），其中R15（R15F：5′AGATCGCAGTTGTATATAGGTACAC3′，R15R：5′CCAGCCGAAAGAGATGGATAG3′）位于2R11942362-11943526bp，為顯性標(biāo)記，擴增片段大小為1164bp，長翅有帶，殘翅無帶;位于2R14414248-14414788bp的R24（R24F：5′AGCAGCGCGTTCTAAGG3′，R24R：5′ATTCAGTGAGCTGTAGCGT3′）為共顯性標(biāo)記，長翅為540bp左右，殘翅為520bp左右。R15與Vg/vg相距941106bp，Vg/vg與R24相距1515403bp。

2.3 雜交結(jié)果及F2個體PCR檢測 用長翅與殘翅雜交，F(xiàn)1全部為長翅，自交后獲得202個F2個體，性狀表現(xiàn)如表1所示。簡易法提取221個樣本（202個F2個體，加上17個F1和2親本）的基因組DNA進行R15和R24的PCR擴增，獲得 186個F2個體的PCR數(shù)據(jù)（圖3）。

2.3.1 等位基因分離規(guī)律的驗證 分別對R15 Vg R24/R15 Vg R24和r15 vg r24/r15 vg r24雜交獲得的F2代R15/r15、Vg/vg和R24/r24 3個位點進行分離規(guī)律的c2檢測。由表2可知，F(xiàn)2代R15/r15和Vg/vg的分離符合3∶1的分離規(guī)律，R24/r24的分離符合1∶2∶1的分離規(guī)律。

2.3.2 非等位基因組合的驗證及重組值 對F2代Vg/vg、R15/r15和R24/r24 3個位點兩兩組合，進行自由組合規(guī)律的c2檢測。由表3可知，F(xiàn)2代Vg/vg-R15/r15不符合9∶3∶3∶1、Vg/vg-R24/r24和R15/r15-R24/r24不符合6∶3∶3∶2∶1∶1的自由組合規(guī)律，差異極顯著，表明它們是連鎖的。

基因間重組值可以用2種方法計算。一種方法是根據(jù)自交F2代雙隱性個體出現(xiàn)比例開方得到雙隱性親型配子的比例，然后獲得重組型配子比例。雙隱性個體無帶殘翅（r15 vg/r15 vg）出現(xiàn)的比例為20.97%，親型配子r15 vg的比例為45.79%，R15/r15-Vg/vg交換值8.42%;雙隱性個體殘翅小帶（vg r24/vg r24）出現(xiàn)的比例為14.52%，親型配子vg r24的比例為38.1%，Vg/vg-R24/r24交換值23.8%。第2種方法是根據(jù)譚遠德[10]三點自交法計算基因圖距的方法，R15/r15-Vg/vg圖距為7.24%，Vg/vg-R24/r24圖距為22.82%，雙交換值為4.33%。2種方法計算得到的交換值基本一致。

3 結(jié)論與討論

果蠅雜交一直是經(jīng)典遺傳學(xué)實驗之一，但因材料要求高、工作量大而常被老師和學(xué)生詬病。孟敏等[11]改進優(yōu)化了雜交實驗的4個環(huán)節(jié)（培養(yǎng)基配制、果蠅性別鑒定、處女蠅培養(yǎng)以及F2代群體擴繁），提高了實驗的成功率。但由于經(jīng)典的三因子連鎖遺傳需要觀察3個性狀，且如剛毛特征一類的性狀必須在解剖鏡下才能觀察，進一步增加了工作量。本研究在性狀考察時只有性別需要在解剖鏡下確認(rèn)，翅型的鑒定不需要解剖鏡，同時2個分子標(biāo)記大小差異較大，1次電泳就可完成，大大減輕了工作量，并且將傳統(tǒng)的有性雜交與分子實驗相結(jié)合，有助于學(xué)生從分子水平上理解遺傳學(xué)。

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（責(zé)編：徐世紅）