滕寶霞,牟建平,賀曉文

(甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院,甘肅 蘭州 730070)

薄荷潤(rùn)唇膏主要成分為：礦油、地蠟、礦脂、甲氧基肉桂酸乙基乙酯、水楊酸乙基乙酯、羊毛脂、薄荷醇、樟腦、藍(lán)桉葉油、歐洲赤松葉油、水楊酸甲酯。由于含有大量油、酯類物質(zhì)，按化妝品微生物檢驗(yàn)[1]中常規(guī)的檢驗(yàn)方法，制備的供試液不能形成均勻的混懸液，薄荷潤(rùn)唇膏中含有薄荷醇[2]、水楊酸乙基乙酯成分[3]，對(duì)部分質(zhì)控菌有一定的抑制作用。進(jìn)行指示菌挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，通過計(jì)數(shù)方法回收率、控制菌生長(zhǎng)試驗(yàn)，建立薄荷潤(rùn)唇膏微生物檢驗(yàn)方法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 薄荷潤(rùn)唇膏

曼秀蕾敦(中國(guó))藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：XK16-108 1377，衛(wèi)妝準(zhǔn)字29-XK-0649 ，國(guó)妝特字G20100002，有效期：2020年10月。

1.2 培養(yǎng)基

卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào)：190221；SCDLP液體培養(yǎng)基，批號(hào)：180202；孟加拉紅瓊脂，批號(hào)：180119；雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)，批號(hào)：180609；Baird-Parker培養(yǎng)基，批號(hào)：190122；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基，批號(hào)：180811；伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)，批號(hào)：190827；十六烷三甲基溴化銨瓊脂，批號(hào)：190813；pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液，批號(hào)：20200312。均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 菌種

大腸埃希菌〔ATCC8739〕、銅綠假單胞菌〔ATCC 27853〕、枯草芽孢桿菌〔ATCC 6633〕、金黃色葡萄球菌〔ATCC6538〕、白色念珠菌〔ATCC10231〕和黑曲霉〔ATCC16404〕。購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。

1.4 設(shè)備

超凈工作臺(tái)(廠家：蘇州蘇凈、型號(hào)：SW-CJ-2D型)、生物安全柜(廠家：ESCD、型號(hào)：CLASS11BSC)、生化培養(yǎng)箱(廠家：上海一恒、型號(hào)：BPMJ-250F)、壓力消毒器(廠家：松下、型號(hào)：MSL-3781L-PC)、恒溫水浴鍋(廠家：杭州米歐儀器有限公司、型號(hào)：WT100-2)、電冰箱(廠家：江蘇白雪、型號(hào)：6C13080177)、顯微鏡(廠家：奧林巴斯、型號(hào)：BX53+DP74)、電熱恒溫干燥箱(廠家：北京科偉永興儀器有限公司、型號(hào)：101-3AB)、天平(廠家：諸暨超澤、型號(hào)：JMA5001)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌種

試驗(yàn)所用菌種為第3代，菌懸液為第4代。

2.2 供試液制備

取薄荷潤(rùn)唇膏 5 g 加到滅菌的三角瓶中，加入 5 mL 滅菌吐溫-80，加入pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液至 100 mL,置于 45 ℃ 水浴中，溶解，用勻漿儀混勻3 min，制成1∶20 g/mL供試液。

2.3 計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)(1)

1)試驗(yàn)組取1∶20 g/mL供試液，分別加入5種試驗(yàn)菌株(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)的菌懸液，制成含菌數(shù)小于 100 cfu 的供試液，取含菌的樣品溶液 1 mL，每個(gè)菌液注2個(gè)平皿，注入所需培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

2)菌液對(duì)照組分別取5種實(shí)驗(yàn)菌的菌懸液(50～100cfu)1 mL 注皿，加培養(yǎng)基、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

3)供試品對(duì)照組用供試品替代實(shí)驗(yàn)組液體注皿，實(shí)驗(yàn)。

4)陰性對(duì)照組用同批配制、滅菌的SCDLP 1 mL 替代樣品注皿，注入培養(yǎng)基、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)(1)的結(jié)果見表1。

表1 薄荷潤(rùn)唇膏計(jì)數(shù)方法(1)挑戰(zhàn)性試驗(yàn)

結(jié)果，采用1∶20 g/mL的供試液 1 mL 注皿，金黃色葡萄球菌的回收率小于50%，方法不可行。

2.4 計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)(2)

將供試液1∶20 g/mL稀釋成1∶50 g/mL和1∶100 g/mL，加入金黃色葡萄球菌的菌懸液，進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)。計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)(2)的結(jié)果見表2。

表2 薄荷潤(rùn)唇膏計(jì)數(shù)方法(2)挑戰(zhàn)性試驗(yàn)

結(jié)果，細(xì)菌總數(shù)采用1∶50 g/mL的供試液 1 mL 注皿，霉菌和酵母菌總數(shù)采用1∶20 g/mL的供試液 1 mL 注皿，回收率試驗(yàn)滿足指示菌挑戰(zhàn)性試驗(yàn)要求，檢驗(yàn)方法可行。

2.5 銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法挑戰(zhàn)性試驗(yàn)

1)試驗(yàn)組。取薄荷潤(rùn)唇膏 1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，加入銅綠假單胞菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。

2)陽性對(duì)照。 將銅綠假單胞菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)加到 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)；同時(shí)測(cè)定銅綠假單胞菌菌懸液菌數(shù)。

3)供試品對(duì)照組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。

4)陰性對(duì)照。同批配制、滅菌， 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)。

銅綠假單胞菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果，見表3

表3 薄荷潤(rùn)唇膏——銅綠假單胞菌方法適用性試驗(yàn)

結(jié)果表明，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版銅綠假單胞菌常規(guī)方法進(jìn)行試驗(yàn)，可以檢出試驗(yàn)菌-銅綠假單胞菌，方法可行。

2.6 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法挑戰(zhàn)性試驗(yàn)

2.6.1 常規(guī)方法

1)試驗(yàn)組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，加入金黃色葡萄球菌菌懸液 1 mL(小于100 cfu)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版金黃色葡萄球菌檢查項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)。

2)陽性對(duì)照將金黃色葡萄球菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)加到 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)；同時(shí)測(cè)定金黃色葡萄球菌菌懸液菌數(shù)。

3)供試品對(duì)照組取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中， 按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。

4)陰性對(duì)照同批配制、滅菌 100 mL SCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)。

金黃色葡萄球菌方法適用性試驗(yàn)(常規(guī)法)結(jié)果，見表4。

表4 薄荷潤(rùn)唇膏控制菌——金黃色葡萄球菌方法適用性試驗(yàn)(常規(guī)法)

結(jié)果表明，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版金黃色葡萄球菌的常規(guī)方法進(jìn)行試驗(yàn)，未檢出試驗(yàn)菌-金黃色葡萄球菌，方法不可行。

2.6.2 培養(yǎng)基稀釋方法

試驗(yàn)組、陽性對(duì)照、供試品對(duì)照組和陰性對(duì)照組SCDLP液體培養(yǎng)基的體積采用 300 mL 進(jìn)行金黃色葡萄球菌 的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 薄荷潤(rùn)唇膏控制菌——金黃色葡萄球菌方法適用性試驗(yàn)(培養(yǎng)基稀釋法)

結(jié)果表明，參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版和《中國(guó)藥典》2015年版1106金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法，增加培養(yǎng)基體積，進(jìn)行挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，檢出試驗(yàn)菌-金黃色葡萄球菌，方法可行。

2.7 耐熱大腸菌群檢驗(yàn)方法挑戰(zhàn)性試驗(yàn)

1)試驗(yàn)組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)到滅菌的試管中，加入大腸埃希菌菌懸液 1 mL(小于 100 cfu)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版耐熱大腸菌群檢查項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)。

2)陽性對(duì)照。將大腸埃希菌菌懸液 1 mL(小于100 cfu)加到 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)；同時(shí)測(cè)定大腸埃希菌菌懸液菌數(shù)。

3)供試品對(duì)照組。取薄荷潤(rùn)唇膏1∶20 g/mL的供試液 20 mL 加入 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)到滅菌的試管中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行試驗(yàn)。

4)陰性對(duì)照。同批配制、滅菌 20 mL 雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基(含中和劑)，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版的要求進(jìn)行檢驗(yàn)。

耐熱大腸菌群方法適用性試驗(yàn)結(jié)果，見表6。

表6 薄荷潤(rùn)唇膏控制菌-耐熱大腸菌群方法適用性試驗(yàn)

結(jié)果表明，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版耐熱大腸菌群的常規(guī)方法進(jìn)行試驗(yàn)，可以檢出試驗(yàn)菌-大腸埃希菌，方法可行。

3 結(jié)論

1)薄荷潤(rùn)唇膏由于含有大量脂溶性基質(zhì)，不易制備成均勻的混懸液。由于薄荷潤(rùn)唇膏對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，細(xì)菌采用 1∶50 g/mL的供試液注皿，真菌采用1∶20 g/mL 的供試液注皿，試驗(yàn)回收率達(dá)到 70%以上，挑戰(zhàn)性試驗(yàn)成功，檢驗(yàn)方法可行。

2)按規(guī)范方法，進(jìn)行指示菌挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，控制菌滿足要求，金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋方法，可以通過挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，表明檢驗(yàn)方法可行。