王申森，劉馨慧，黃 華，李 歡，王 娟

(北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京 100124)

胰腺癌是最常見的胰腺腫瘤，主要起源于胰腺導管上皮及腺泡細胞的細胞惡性轉變，因為其發(fā)病率和死亡率都高居全球惡性腫瘤前十位并且是預后最差的惡性腫瘤之一，所以被稱為“癌中之王”. 因此，對胰腺癌發(fā)生及發(fā)展過程的研究具有極為重要的科研及臨床意義.

Claudin 4(Cldn4)是一種緊密連接蛋白，是Claudin家族的一員，Claudin蛋白均由4個跨膜結構域構成，N端和C端均位于細胞內部，細胞膜外有2個長度不等的環(huán)，可以和臨近其他同類型的環(huán)相接觸構成細胞間的緊密連接[1-3]. 而且Cldn4的結構高度保守，從線蟲到人類都十分相似. 當Claudin蛋白發(fā)生變化時將影響細胞間的通透性進一步引起多種疾病的發(fā)生[4-6].

目前已報道Cldn4在卵巢癌[7-9]、前列腺癌[10-11]、乳腺癌[12-13]、胰腺癌[14]、腸道癌等[15]多種腫瘤中表達上調[16]，并且作為一種癌基因介導癌癥的發(fā)生，但是在胰腺癌中將作為一種抑癌基因還是癌基因仍有爭議：Michl等[17]研究表明Cldn4能夠降低胰腺癌細胞SUIT-2的侵襲和轉移能力，而Kumei等[18]研究表明使用羅格列酮可以通過抑制 MEK-ERK 信號通路增加Cldn4的表達，從而降低了胰腺癌細胞的侵襲力. 本文將通過對胰腺癌細胞PANC-1進行研究進一步確定Cldn4對胰腺癌細胞遷移能力的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胰腺癌細胞PANC-1和293T細胞購自中國科學院細胞庫；Cldn4抗體購自abcom；MTT試劑盒購自索萊寶；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒、Real time PCR 試劑盒、qPCR引物序列購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；Transwell小室購自Corning；細胞裂解及蛋白抽提試劑、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、Western blot配膠試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司.

1.2 細胞增殖檢測

收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，分于96孔板，每孔150 μL，2 000個細胞/孔. 置37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)使細胞貼壁，培養(yǎng)6～24 h. 小心吸去上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h. 然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解. 在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值. 同時設置調零孔(培養(yǎng)基、MTT、Formazan溶解液)，每組設定3復孔.

1.3 克隆形成實驗

取對數生長期細胞，PBS清洗，胰酶消化，加DMEM完全培養(yǎng)基進行吹打重懸，制成單細胞懸液. 血球計數板計數，根據細胞增殖能力，在六孔板中，對照組和實驗組分別鋪入200個細胞，于細胞培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)2周. 當培養(yǎng)板出現肉眼可見的克隆時，終止實驗，4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.1%結晶紫染色20 min,清水洗凈染色液. 干燥克隆培養(yǎng)板，拍照，記錄實驗結果.

1.4 細胞劃痕實驗

在超凈工作臺內對實驗所用到的馬克筆、直尺、所用器材等進行紫外照射滅菌30 min. 鋪細胞前用馬克筆在六孔板外底部每隔0.5 cm畫一條線，每個孔劃4條線，在板中鋪約5×105個細胞，使細胞第2天能鋪滿整個孔面. 根據孔板外底部的線進行劃線，槍頭要直，不能傾斜，避免劃得粗細不均，PBS清洗劃下的細胞，沿壁輕輕加入完全培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 按0、24、48 h的時間點顯微鏡下拍照. 每次都要在同一固定觀察點觀察劃痕愈合情況. 用Image J軟件測量劃痕區(qū)域長度，計算細胞遷移能力. 計算公式：劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%.

1.5 Transwell實驗

選取處于對數生長期的細胞，即細胞密度達到80%～90%時，PBS清洗2～3遍，胰酶消化3 min左右(根據細胞的貼壁能力)，加DMEM完全培養(yǎng)基進行吹打，800 r/min離心細胞. 離心細胞后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1～2次，加入無血清培養(yǎng)基，重懸細胞，吸取1 mL細胞懸液再加入無血清培養(yǎng)基進行稀釋，血球計數板進行細胞計數,調整細胞密度為104/mL. 將Transwell小室置于24 孔板中，上室加入200 μL的細胞懸液，下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL. 在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h. 將24孔板從培養(yǎng)箱中取出，用移液器吸取上室的培養(yǎng)基，PBS溶液清洗小室2次，棉簽擦去上室細胞，室溫4%多聚甲醛固定細胞30 min，0.1%結晶紫染色15 min，清洗. 倒置顯微鏡下觀察穿過小室的細胞量. 隨機選擇5個視野進行拍照、計數取平均數.

1.6 Real-Time PCR檢測

將細胞融合度在80%左右的各組細胞處理后使用TRIzol提取RNA，使用cDNA反轉錄試劑盒反轉錄cDNA,以β-Actin為內參進行qPCR，引物如下：Cldn4-F：ATGCAGTGCAAGGTGTACGA，Cldn4-R：GACACCGGCACTATCACCAT；β-Actin-F：TGACG TGGACATCCGCAAAG，β-Actin-R：CTGGAAGGTG GACAGCGAGG. 結果使用2-ΔΔCt相對定量法計算mRNA表達水平.

1.7 Western blot

將細胞融合度在80%左右的各組細胞處理后使用含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液和RIPA將蛋白定量，沸水浴10 min變性，上樣后進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠80 V 30 min ，分離膠120 V 1.5 h)并轉膜(90 V恒壓濕轉1 h)到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12 h，使用對應二抗孵育后進行顯影.

1.8 病毒包裝與感染

將293T細胞鋪于10 cm皿中待細胞生長到70%左右使用轉染試劑將穿梭質粒和包裝質粒按照一定比例共轉染到細胞中，12 h后進行換液. 分別在轉染后48 h和72 h收取細胞培養(yǎng)液加入5×PEG8000在4 ℃冰箱中放置2 h，其間搖勻2～3次. 3 000 r/min離心30 min，棄上清后使用DMEM重懸病毒沉淀分裝后放置于-80 ℃冰箱備用. 將PANC-1細胞鋪于6孔板中，待細胞生長到70%左右加入對應的病毒感染細胞，6 h后換液，48 h后加入對應的抗生素篩選細胞.

1.9 細胞的構建

為了構建過表達Cldn4的細胞系，使用引物F：gtgaccggcgcctactctagaATGGCCTCCATGGGGCTACA GG和引物R：gccctcagcggccgcggatccTTACACGTA GTTGC TGGCAGCAGC以人源cDNA為模板將Cldn4的開放閱讀框調取出，并同源重組至慢病毒載體pCDH-EF1α-MCS-T2A-puro. 在293T細胞中包毒后感染PANC-1細胞，使用2 μg/mL的嘌呤霉素篩選出陽性細胞.

為了構建敲低Cldn4的細胞系(shCldn4)，使用引物F：gatcGCTTTGTTCTTCCCTGGACTGTCAAGA GCAGTCCAGGGAAGAACAAAGCttttt和R：aattAAA AAGCTTTGTTCTTCCCTGGACTGCTCTTGACAGTCCA GGGAAGAACAAAGC退火形成雙鏈后，并連接組至慢病毒載體pLVX-shRNA2-Puro. 在293T細胞中包毒后感染PANC-1細胞，使用2 μg/mL的嘌呤霉素篩選出陽性細胞.

1.10 統計學處理

采用Origin軟件進行數據統計與作圖，多因素方差分析采用Bonferroni post-tests方法進行，計量資料采用均數±標準差(x±s)表示. 所得數據進行正態(tài)分布檢驗，組間比較采用t檢驗與單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義. 其中*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2 結果與分析

2.1 Cldn4在腫瘤中表達量異常

通過TCGA數據庫的搜索發(fā)現，Cldn4在腫瘤中mRNA的表達量顯著性高于正常組織中的表達量(如圖1所示，T代表tumor，N代表normal)，與Michl等[17]文獻中報道的結果相同：在胰腺癌中Cldn4表達量異常上升. 這表明Cldn4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中可能存在一定的作用.

圖1 Cldn4在胰腺癌和正常組織中的表達量Fig.1 Expression of Cldn4 in pancreatic cancer and normal tissue

2.2 胰腺癌細胞系中Cldn4的表達量

通過qPCR和Western blot檢測胰腺癌PANC-1細胞中經過慢病毒穩(wěn)定過表達和敲低Cldn4后Cldn4的mRNA和蛋白水平. 過表達Cldn4后Cldn4在mRNA水平和蛋白水平均有顯著性差異(如圖2(a)和圖2(b)右圖所示)；敲低Cldn4后Cldn4在mRNA水平和蛋白水平均有顯著性差異(如圖2(a)和圖2(b)左圖所示).

圖2 PANC-1細胞中過表達和敲低Cldn4后mRNA和蛋白的表達水平Fig.2 Expression levels of Cldn4 mRNA and protein in PANC-1 cells after overexpress and knockdown Cldn4

2.3 Cldn4不影響細胞的增殖

分別將胰腺癌PANC-1細胞中穩(wěn)定過表達和敲低Cldn4的細胞同對照組細胞等量鋪于96孔板中，取0、24、48、72、96 h的細胞使用MTT試劑盒進行檢測. 無論過表達還是敲低Cldn4均對胰腺癌細胞PANC-1的增殖沒有顯著性影響，如圖3所示. 本結果表明Cldn4并不影響胰腺癌細胞的增殖能力.

圖3 過表達和敲低Cldn4后對PANC-1細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on proliferation of PANC-1 cells

2.4 Cldn4抑制細胞的遷移能力

分別將胰腺癌PANC-1細胞中穩(wěn)定過表達或敲低Cldn4的細胞同對應對照組細胞鋪于24孔板中，待細胞貼壁后進行劃痕并拍照，每24 h進行拍照觀察. 過表達Cldn4與對照組對比結果顯示過表達Cldn4后能夠抑制胰腺癌細胞劃痕愈合的速度(如圖4(a)(c)左側圖所示)；敲低Cldn4與對照組對比結果顯示降低Cldn4的表達后能夠促進胰腺癌細胞劃痕愈合的速度(如圖4(b)(c)右側圖所示)，結果如圖4所示.

圖4 過表達和敲低Cldn4后對PANC-1細胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on migration of PANC-1 cells

另一種方法使用Transwell細胞遷移實驗驗證Cldn4對胰腺癌細胞遷移的影響. 過表達Cldn4與對照組對比結果顯示Cldn4表達量上升后能夠抑制胰腺癌細胞穿過Transwell小室的能力(如圖5(a)(c)左圖所示)；敲低Cldn4與對照組對比結果顯示降低Cldn4的表達后能夠促進胰腺癌細胞穿過Transwell小室的能力(如圖5(b)(c)右圖所示). 以上結果證明Cldn4能有效抑制胰腺癌細胞的遷移能力. 結果如圖5所示.

圖5 過表達和敲低Cldn4后對PANC-1細胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on migration of PANC-1 cells

3 討論

Cldn4是Claudins蛋白家族的一員，并且是細胞黏附結構的重要連接蛋白之一. 有假說認為在腫瘤代謝中Claudins的降低能夠加強腫瘤的轉移和入侵；另一方面有的研究表明Claudins的過量表達能夠導致腫瘤中蛋白的定位和功能異常，進而促進腫瘤的轉移和入侵. 目前研究發(fā)現Cldn4在多種腫瘤中表達量異常升高，且在卵巢癌、腸道癌、乳腺癌等癌癥中被證明作為一種癌基因促進腫瘤的發(fā)生；而在胃癌中發(fā)現Cldn4扮演著抑癌基因的角色[19]. 文獻報道證明和數據庫均顯示Cldn4在胰腺癌中異常表達升高，提示Cldn4在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要的角色，但是在胰腺癌中Cldn4的功能并不明確.

為探討Cldn4在胰腺癌中的作用，本實驗使用慢病毒的方法構建了穩(wěn)定過表達Cldn4和穩(wěn)定敲低Cldn4的PANC-1細胞系，并通過qPCR和Werstern blot檢測Cldn4的表達水平變化. 本文通過細胞增殖檢測實驗發(fā)現，Cldn4并不影響胰腺癌細胞的增殖，但是通過細胞劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗證明Cldn4能夠抑制胰腺癌細胞遷移，這表明Cldn4在胰腺癌細胞中可能扮演著抑癌基因的角色，但其具體的分子調控機制并未闡述. 綜合Cldn4的文獻報道和最新的研究，猜測其在胰腺癌中的抑癌機制可能與乳腺癌中報道的相關通路PAK4-CEBPB-Cldn4有關[20]；或者與胃癌中報道的PI3K/Akt 途徑有關[19]. 而Cldn4表達量的變化可能與之前報道過的基因的甲基化改變有關[21]，或者非編碼RNA能夠控制Cldn4的表達[22].

Cldn4在很多腫瘤中異常表達，已經有文獻報道將Cldn4作為治療腫瘤的特定靶點. Cldn4是產氣莢膜梭菌腸毒素(clostridium perfringens enterotoxin，CPE) 的受體，CPE結合Cldn4后可通過胞膜穿透作用使細胞溶解壞死. Michl等[14]用CPE瘤內注射異種嫁接的胰腺癌細胞，引起腫瘤細胞的大面積死亡，延緩腫瘤的生長. 在前列腺癌細胞和高表達Cldn4的腫瘤中也報道過CPE有治療效果[23-24]. 目前也有研究證明CAR-T對部分Claudins有一定的作用，希望后期能夠研究出針對Claudins的CAR-T細胞療法[25].

Cldn4作為十分常見的腫瘤異常表達基因，對于其研究仍處于初步階段，仍需要對其調節(jié)機制進行進一步的了解和報道，這對于了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極為重要的理論和實踐意義.

4 結論

1) Cldn4在胰腺癌中異常高表達.

2) Cldn4能夠顯著抑制胰腺癌細胞PANC-1的遷移能力.

3) Cldn4對胰腺癌細胞PANC-1的增殖能力無顯著影響.