王麗紅，孟卓異，林麗穎，宮益霞，張 宇，孫長海，趙 宏

（佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯 154007）

抑郁癥是一種常見的精神疾病，會對生活產生負面影響。三分之二的抑郁癥患者會產生自殺念頭，自殺率從10%～15%不等?；?950年代單胺神經遞質（如5-羥色胺或去甲腎上腺素）的偶然發(fā)現，到目前為止，對抑郁癥的治療完全取決于抗抑郁藥，而這些抗抑郁藥只對約50%的患者完全起效[1]。因此，迫切需要更有效的抗抑郁藥。

刺五加為東北道地藥材五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus（Rupr. et Maxim.） Harms）的干燥根及根莖或莖。在西伯利亞大河地區(qū)被稱為“西伯利亞人參”，在中國、韓國、俄羅斯和日本普遍用作傳統(tǒng)中草藥[2?4]。刺五加的根、根莖和莖枝可以通過干擾抑郁癥大鼠腦中五羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）關鍵酶的表達來產生抗抑郁作用[5]。云芝（Coriolus versicolor（L. ex Fr.） Quel）在東方醫(yī)學中的應用歷史悠久，也被稱為“火雞尾巴”，是一種專性需氧菌，常出現在樹干、樹枝、枯枝和樹樁上。云芝早在《本草綱目》中就有記載，在中國已有超過400年的藥用歷史。云芝提取物具有多種生物學活性，包括抗微生物、抗病毒、免疫調節(jié)、保肝和抗腫瘤等[6?7]。

刺五加和云芝長期以來一直作為具有鎮(zhèn)靜催眠和提高免疫力的保健食品被廣泛研究及應用[8?12]，但將兩者進行配伍使用的研究尚無記載。刺五加作為寧心安神類藥物在中國藥典中記載的中藥復方中僅有腦靈液一種。本課題將刺五加與云芝兩者配伍使用，主要研究二者聯用的抗抑郁作用、聯用的最適劑量以及抗抑郁的作用機制，旨在獲得一種天然的，毒副作用低的對抑郁癥有治療作用的保健藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加及云芝 均采自黑龍江，經鑒定為正品；無水乙醇、冰乙酸 天津市凱通化學試劑有限公司；氯化鈉注射液 吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司；利血平 阿拉丁試劑上海有限公司，≥99.5%；鹽酸氟西汀 蘇州中化藥品工業(yè)有限公司；鼠5-HT ELISA KIT 、鼠去甲腎上腺素（NE）ELISA KIT、鼠白細胞介素IL-10、IL-1βELISA KIT 上海紀寧實業(yè)有限公司，批號：CK-E20162；實驗動物為雄性昆明小鼠，體重18～22 g 由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，合格證書SCXK（黑）-2013-001。

臺式低速離心機、酶標儀 賽默飛世爾上海儀器有限公司；FA2004型分析天平儀 上海越平科學儀器蘇州制造有限公司；SK5210HP型超聲波清洗器

上海科導超聲儀器有限公司；FW-177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 刺五加和云芝按生藥量配比分為刺五加組（AS）、云芝組（CV），刺五加和云芝不同配比組（AC-1:1、AC-1:2、AC-1:3、AC-1:4、AC-1:5、AC-5:1、AC-4:1、AC-3:1、AC-2:1），精確稱取的各配伍比例的刺五加和云芝粉末共11.25 g，將原料粉末置于錐形瓶中，使用75%乙醇溶液為提取溶劑，液料比為25:1（mL/g），浸泡過夜后采用超聲輔助提取法，超聲功率120 W，提取時間2 h，提取液濃縮后使用生理鹽水定容至25 mL容量瓶中，制成濃度為0.45 g/mL的混懸液，以待使用。。

1.2.2 動物分組給藥及小鼠抑郁模型的建立

1.2.2.1 動物分組及給藥 實驗動物為雄性昆明小鼠，體重18～22 g。給藥前小鼠適應性飼養(yǎng)7 d。小鼠按體重隨機進行分組，設空白組、對照組、模型組，刺五加組，云芝組，刺五加-云芝不同配比組（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、4:1、3:1、2:1）共14組，每組10只，根據小鼠給藥劑量每日早間灌胃一次不同配比組提取液。小鼠給藥劑量按人類最大給藥劑量乘以9.1進行換算為4.55 mg·kg?1。懸尾實驗及強迫游泳實驗分為空白組、對照組及各給藥組；利血平拮抗實驗分為空白組、對照組、模型組及各給藥組。在實驗過程中，空白組及模型組灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃鹽酸氟西汀溶液（20 mg·kg?1），連續(xù)灌胃14 d。

1.2.2.2 小鼠懸尾實驗 灌胃給藥第12 d，按照Steru[13?14]的方法，灌胃給藥后將小鼠放置于實驗室60 min，使小鼠適應實驗室環(huán)境。實驗開始時，將小鼠尾巴尖端2 cm左右懸掛于實驗裝置上，小鼠與底部有一段距離，使小鼠倒置空中時無所攀抓，經一段時間后小鼠因失望而減少活動，模擬抑郁狀態(tài)建造小鼠行為絕望模型。實驗總用時6 min，并記錄小鼠后4 min的懸尾不動時間（小鼠在懸掛處完全停止掙扎或者有微小的肢體顫動）?？疾觳煌o藥組對小鼠懸尾不動時間（TST）的影響。

1.2.2.3 小鼠強迫游泳實驗 在正式強迫游泳實驗24 h前，將小鼠放入實驗設備中預游15 min，使小鼠適應環(huán)境。灌胃給藥第13 d，給藥1 h后，將小鼠放置于水溫控制在（25.0±1.0）℃的塑料水槽中，水深至鼠四爪不可觸底，經歷一段時間后，小鼠因放棄而大幅度減少活動幅度以及活動時間，活動之間有長時間的不動間歇為失望行為。實驗總用時6 min，記錄后4 min的小鼠游泳不動時間[15]?？疾觳煌o藥組對小鼠強迫游泳不動時間（FST）的影響。

1.2.2.4 利血平拮抗實驗 灌胃給藥第14 d，根據Xu等[16?17]的利血平拮抗實驗方法，對照組、模型組和給藥組均于末次給藥后測量小鼠肛溫，并于1 h后腹腔注射利血平溶液（4 mg·kg?1）（精確稱量1 mg利血平粉末，加10%冰乙酸溶液定容至10 mL容量瓶，配制成0.1 mg·mL?1利血平溶液），空白組同時間腹腔注射等量生理鹽水。1 h后觀察小鼠上眼瞼下垂表現。眼瞼下垂有如下四個等級，依此計算分數，眼全閉為4分，眼閉3/4為3分，眼閉1/2為2分，眼閉1/4為1分。2 h后測小鼠肛溫，以將體溫計探頭完全插入小鼠肛門，至少維持2 min[16?17]。

1.2.3 血樣及腦的采集與測定 在利血平拮抗實驗結束24 h后將小鼠脫頸處死，期間小鼠禁食。實驗時眼球取血后斷頭取小鼠大腦0.2 g置于生理鹽水中冰浴勻漿，10000 r/min的條件下離心，離心15 min，取上清液，依照酶聯免疫試劑盒說明書采用ELISA法測定血清中IL-10、IL-1β及小鼠腦中神經遞質5-HT、NE的含量[18]。

1.3 數據處理

根據多指標綜合分析法，整合多個檢測指標。評分時小鼠懸尾及強迫游泳實驗以對照組為參照，其余實驗組以模型組為參照，各指標數據進行標準化處理，即標化值=（給藥組?對照組或模型組）/（正常組?對照組或模型組）。

2 結果與討論

2.1 對小鼠懸尾和強迫游泳不動時間的影響

結果如表1所示。從結果中可以看出，與空白組比較，不同給藥組均能縮短小鼠在懸尾實驗及強迫游泳實驗中的不動時間。除云芝組、刺五加與云芝比例為1:5、3:1、2:1組外，其余各實驗組均P<0.05，均有統(tǒng)計學意義。

從對小鼠懸尾行為影響來看，與空白組相比，刺五加-云芝1:2比例組極顯著（P<0.01）降低了不動時間，組間兩兩比較，1:1和1:2劑量組無顯著性差異（P>0.05）。從對小鼠強迫游泳行為影響來看，與空白組相比，1:2比例組極顯著降低小鼠不動時間極顯著（P<0.01），組間兩兩比較，1:1和1:2比例組無顯著性差異（P>0.05）。實驗結果表明，不同配比組均能夠明顯縮短小鼠不動時間，其中刺五加與云芝比例為1:2時效果最好，其次為1:1。刺五加-云芝1:1和1:2比例組實驗效果略次于陽性對照組，但差異不顯著（P>0.05）。

表1 不同配比組對小鼠懸尾和強迫游泳不動時間的影響（n=10, ±s）Table 1 Effects of all groups on immobility time in TST and FST in mice (n=10, ±s)

表1 不同配比組對小鼠懸尾和強迫游泳不動時間的影響（n=10, ±s）Table 1 Effects of all groups on immobility time in TST and FST in mice (n=10, ±s)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05；表2～表4同。

組別 懸尾不動時間（s） 游泳不動時間（s）陽性對照 72.65±1.23d 57.65±1.23f空白 123.62±9.54a 108.62±9.54a 1:1 88.62±4.18cd 73.28±4.48def 1:2 85.36±7.01cd 69.36±5.80ef 1:3 101.31±1.35bc 85.65±2.52cde 1:4 100.30±6.01bc 85.70±5.35cde 1:5 107.71±5.17ab 95.24±5.03abc 5:1 91.98±11.70bc 77.69±11.74cde 4:1 101.08±12.40bc 85.67±12.58cde 3:1 122.40±20.52a 107.29±20.64ab 2:1 108.54±12.02ab 94.33±13.40abc刺五加 100.18±8.89bc 84.94±8.61cde云芝 108.52±7.54ab 90.10±2.26bcd

表2 對抑郁模型小鼠體溫及眼瞼下垂的影響（n=10, ±s）Table 2 Effects of body temperature and blepharoptosis in depression model mice (n=10, ±s)

表2 對抑郁模型小鼠體溫及眼瞼下垂的影響（n=10, ±s）Table 2 Effects of body temperature and blepharoptosis in depression model mice (n=10, ±s)

組別 給藥2 h后肛溫（℃） 眼瞼下垂評分陽性對照 36.7±0.2dbc 1.88±0.83bcd空白 37.5±0.6a 0.00±0.00e模型 35.5±0.4f 3.38±0.52a 1:1 36.7±0.3b 1.63±0.74cd 1:2 36.9±0.3bc 1.50±0.76d 1:3 36.5±0.2bcde 1.63±0.52cd 1:4 36.6±0.2bcde 2.00±0.93bcd 1:5 36.3±0.4cde 1.88±0.83bcd 5:1 36.4±0.5bcde 2.00±0.93bcd 4:1 36.2±0.3de 2.38±0.92bcd 3:1 36.3±0.6cde 2.50±0.76bc 2:1 36.4±0.2cde 1.88±0.83bcd刺五加 36.4±0.3cde 2.00±1.07bcd云芝 36.1±0.4e 2.63±1.06ab

2.2 對小鼠眼瞼下垂和體溫的影響

結果如表2所示。從結果中可以看出，模型組腹腔注射利血平后，與空白組比較，模型組小鼠體溫極顯著降低，眼瞼下垂評分極顯著升高（P<0.01），證明此次造模成功。實驗結果表明不同劑量組均能明顯降低眼瞼下垂評分以及抑制小鼠體溫下降，且與模型組比較均有顯著性差異（P<0.05，P<0.01），證明具有統(tǒng)計學意義。在抑制小鼠體溫下降和眼瞼下垂實驗結果中，1:2比例組效果最佳。

2.3 對小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影響

結果見表3。與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-10濃度降低，具有極顯著性差異（P<0.01）證明造模成功。與模型組相比，除5:1和4:1組外，各劑量組均能不同程度提高小鼠血清中IL-10的含量。各組中刺五加-云芝比例為1:2中IL-10水平最高，1:1組次之，兩組組間無顯著差異（P>0.05）。與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-1β濃度明顯升高，與空白組比較具有極顯著性差異（P<0.01）。實驗數據表明，刺五加-云芝劑量組1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，能明顯降低小鼠血清中IL-1β的含量，且與模型組比較有顯著性差異（P<0.05），具有統(tǒng)計學意義。

表3 對小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影響（n=10, ±s）Table 3 Effect of serum IL-10 and IL-1β content in mice (n=10, ±s)

表3 對小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影響（n=10, ±s）Table 3 Effect of serum IL-10 and IL-1β content in mice (n=10, ±s)

組別 IL-10（pg·mL?1） IL-1β（pg·mL?1）陽性對照 711.56±35.56abc 106.72±0.19abc空白 761.56±18.95a 78.87±2.24f模型 567.11±30.87ef 122.29±17.64a 1:1 729.70±37.22ab 83.04±7.60df 1:2 731.93±94.19ab 79.64±17.44f 1:3 704.89±37.47abc 84.79±3.62cde 1:4 653.41±8.98bcd 89.84±16.92bcdf 1:5 666.00±9.62bcd 86.55±5.17cde 5:1 564.52±50.69ef 92.36±5.36abcde 4:1 551.56±4.44f 102.55±4.75bcd 3:1 616.37±7.80def 96.96±5.79abcde 2:1 640.44±36.87cde 98.50±9.88abcd刺五加 606.37±17.96def 109.57±0.33ab云芝 668.22±102.15bcd 100.69±11.69abcd

根據實驗數據，小鼠抑郁模型能改變小鼠血清中炎性因子IL-10、IL-1β的含量，使IL-10降低，IL-1β升高。刺五加-云芝配比組能抑制這種效果，且刺五加-云芝比例為1:1、1:2時作用明顯。且從兩組實驗結果來看，刺五加-云芝比例為1:1、1:2時抑制IL-1β的含量升高的作用效果明顯優(yōu)于對照組，兩組與陽性對照組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01），具有統(tǒng)計學意義。

表4 對小鼠腦內5-HT和NE含量的影響（n=10, ±s）Table 4 Effect of 5-HT and NE contents in mice brain (n=10, ±s)

表4 對小鼠腦內5-HT和NE含量的影響（n=10, ±s）Table 4 Effect of 5-HT and NE contents in mice brain (n=10, ±s)

組別 5-HT（ng·mL?1） NE（ng·mL?1）陽性對照 299.77±21.13c 6.25±0.40abc空白 308.92±17.31c 5.62±0.64abcd模型 178.40±5.47fg 4.02±0.37e 1:1 371.13±88.59b 6.47±0.9ab 1:2 498.83±6.07a 6.63±0.88a 1:3 252.35±10.66de 5.76±0.41abcd 1:4 164.08±3.66h 5.09±0.46d 1:5 195.54±10.78efg 5.27±0.35cd 5:1 208.45±13.44defg 5.32±0.79cd 4:1 236.15±4.47def 5.55±0.48abcd 3:1 242.02±19.94def 5.36±1.05bcd 2:1 243.90±15.51def 5.43±0.61bcd刺五加 263.15±8.69cd 5.95±0.47abcd云芝 218.08±2.93cdef 4.91±0.67de

2.4 對小鼠腦中5-HT和NE含量的影響

實驗結果如表4所示。與空白組相比，模型組小鼠腦中5-HT、NE濃度顯著降低，證明模型建立成功。按小鼠腦中5-HT含量結果分析，與其他劑量組相比，刺五加-云芝比例為1:2時作用效果最好，1:1次之，與模型組相比有極顯著性差異（P<0.01），且兩組治療效果明顯優(yōu)于對照組及刺五加、云芝單味藥組，組間比較具有顯著性差異（P<0.05）。按小鼠腦中NE含量結果分析，與其他劑量組相比，刺五加-云芝比例為1:2時作用效果最好，與模型組相比有極顯著性差異（P<0.01）。

綜合實驗結果，在刺五加-云芝不同配比組對小鼠腦中5-HT和NE含量的影響實驗中，最佳的配伍比例為1:2，且在對小鼠腦中5-HT影響實驗中1:2比例組作用效果明顯優(yōu)于對照組，組間具顯著性差異（P<0.05），具有統(tǒng)計學意義。

2.5 抗抑郁作用各檢測指標總效應

根據多指標綜合分析法，整合多個檢測指標。評分時小鼠懸尾及強迫游泳實驗以對照組為參照，其余實驗組以模型組為參照，各指標數據進行標準化處理，即標化值=（給藥組?對照組或模型組）/（空白組?對照組或模型組）。參考專家評分，本研究確定各指標系數為：懸尾及強迫游泳不動時間為2，體溫及眼瞼下垂評分為1，IL-10和IL-1β為1、5-HT、NE為3。各指標數據的標化值乘以各自權重系數后的加合值即得刺五加-云芝不同配伍比例對于抑郁癥模型小鼠治療作用的總效應值（TE）。實驗結果如表5所示，綜合各組實驗結果證明，各不同配伍比例組1:1、1:2、1:3治療效果最佳且明顯優(yōu)于刺五加單味藥組，其中刺五加-云芝比例為1:2是總效應值（TE）最高，證明其是抗抑郁作用最優(yōu)配伍。

3 討論與結論

抑郁癥病因復雜，最著名的假說為多種胺代謝障礙假說，其認為5-HT水平的下降，是抑郁癥患者和躁狂病人發(fā)生的共同基礎，5-HT水平的下降只是容易引起情感方面的障礙。抑郁癥的發(fā)病則需NE功能改變的參與，5-HT參與其中兩者相互作用，引起癥狀。中樞腦內5-HT和NE水平均下降，就會引起抑郁癥的發(fā)生；另有研究證明抑郁癥的發(fā)生與機體免疫功能有著密切聯系，炎性因子及促炎因子白細胞介素含量的變化能夠反應出機體抑郁癥的致病程度，通過降低促炎性細胞因子或增強抗炎因子的活性，均能降低IDO過度表達，減少抑郁癥狀的發(fā)生[19?21]。

黃芷熠等[22]將刺五加-山楂按照不同比例配伍，通過行為學實驗、利血平拮抗實驗觀察其提物對抑郁癥模型小鼠的影響。將其實驗結果與刺五加-云芝抗抑郁能力進行對比后發(fā)現，二者均具有良好的抗抑郁作用，本文結果表明，與單獨使用刺五加和云芝相比，刺五加-云芝組可使小鼠血清中的IL-10水平和海馬中的5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）水平顯著升高（P<0.05），同時IL-1β降低。綜合上述實驗結果，證明刺五加-云芝配伍使用對各實驗指標具有明顯的改善作用，刺五加-云芝配伍后抗抑郁作用效果高于單用，同時優(yōu)于陽性對照組鹽酸氟西汀，二者配伍使用后發(fā)揮了協同增效的作用，兩者最佳配伍比例為1:2。上述研究結果可為抑郁癥的臨床治療及抗抑郁藥物的篩選、開發(fā)和利用提供的新的思路和理論基礎。

表5 不同比例配伍的刺五加-云芝標化值和總效應值Table 5 Standardized indexes and total effect values of the investigated Acanthopanax senticosus-Coriolus versicolor