田軍 宋鐵鷹 宋春旺 戶月 王虹 張?jiān)谕?王文立

沙利度胺(Thalidomide)是一種合成谷氨酸衍生物，為非巴比妥類藥物，于1957年由德國的Chemie Gruenenthal制藥公司生產(chǎn)，作為一種鎮(zhèn)靜和止吐劑被引入市場。其針對(duì)惡心、嘔吐等早孕反應(yīng)的效果理想。而由于20世紀(jì)60年代出現(xiàn)的嚴(yán)重的致胎兒畸形的不良反應(yīng)，而迅速被禁止使用[1]，退出市場。但最新研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺同時(shí)具備調(diào)節(jié)免疫和拮抗血管生成的作用[2]，而且，在惡性黑色素瘤、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑等則顯示出良好療效，而回歸市場[3-5]。同時(shí)應(yīng)用于治療骨髓增生異常綜合征和多發(fā)性骨髓瘤[6,7]。而且，越來越多的關(guān)于沙利度胺作為鎮(zhèn)痛劑或鎮(zhèn)痛輔助劑的臨床應(yīng)用，被報(bào)道和進(jìn)一步研究[8-10]。瞬時(shí)感受器電位(TRP)通道，是位于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的一大類離子通道，分布廣泛。它們與感知溫度、有毒物質(zhì)和疼痛有關(guān)。研究表明，在免疫應(yīng)答和痛覺感受中TRP通道起著重要作用[11]。 TRPV1是TRPV家族中目前研究較多的成員之一，是一種人體分布較廣泛的非選擇性陽離子通道。早期研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1在外周感覺神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，近來人們認(rèn)識(shí)到，TRPV1也可能存在于非神經(jīng)元細(xì)胞和組織中，可被多種內(nèi)源性或外源性介質(zhì)激活或致敏，尤其可介導(dǎo)疼痛的產(chǎn)生和痛覺增敏[12,13]。在TRPV1被發(fā)現(xiàn)后的二十多年中，越來越多的證據(jù)支持(TRP)通道和生理性、病理性疼痛有關(guān)，而逐漸成為當(dāng)前疼痛研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[14,15]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型小鼠：40只雄性C57小鼠，25～28 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物合格證編號(hào)：1902095，TRPV1基因敲除小鼠：來自中國中南民族大學(xué)。所有的老鼠都被飼養(yǎng)于12 h的明暗交替的清潔環(huán)境中，并被允許隨意獲取食物和水。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，利用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分組；TRPV1基因敲除小鼠分為2組，分別為空白對(duì)照組和沙利度胺組；野生型小鼠分為2組，分別是模型組、通路抑制劑(A784168)組：每組20只，每組分為2個(gè)亞組，分別為對(duì)照組、沙利度胺組，其中每個(gè)亞組10只。小鼠正常進(jìn)食水，實(shí)驗(yàn)前12 h，停止進(jìn)食。這項(xiàng)研究嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南中的建議進(jìn)行。本方案經(jīng)石家莊市第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 人胚胎腎細(xì)胞293(HEK293)細(xì)胞培養(yǎng) TRPV1通路過表達(dá)HEK293細(xì)胞，購自上海佰利公司(中國)。HEK293細(xì)胞于10%牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)：37℃、5%CO2、95%空氣，每3天傳代1次。研究中，單克隆細(xì)胞暫混合在一起培養(yǎng)，然后在實(shí)驗(yàn)前一天放入96孔的培養(yǎng)皿中。

1.3 小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)解剖后，置入低溫DMEM溶液中(pH值7.4)。去除其周圍結(jié)締組織，切碎DRGs，將其碎片置于振蕩水浴中(5 ml DMEM 35℃)孵育30 min，同時(shí)加入0.25 mg/ml的胰蛋白酶、1.0 mmol/L的膠原酶和0.1 mmol/L的脫氧核糖核酸酶(Dnase)。消化解離后，加入FBS至10%停止消化，離心5 min(1 000 r/min)。細(xì)胞顆粒在DMEM/F-12中再次懸浮，使用過濾器過濾(130 μm)。分離DRG神經(jīng)元(1.0 ml)種植于24孔板(預(yù)涂0.1 mg/ml多聚-L-賴氨酸，2.5×105細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)溫度在37℃。并于下一個(gè)24 h，加入對(duì)非神經(jīng)元細(xì)胞的生長有抑制作用的阿糖胞苷(5 μg /ml)。在實(shí)驗(yàn)前1 d，DRG神經(jīng)元被進(jìn)一步培養(yǎng)72 h，然后接種到96孔板中。本研究使用的培養(yǎng)基為DMEM/F-12(1∶1)，添加5%胎牛血清，2%不含抗氧化劑的B-27 (Gibco,USA)和L-谷氨酰胺(0.1 mg/ml)。

1.4 藥物制備 沙利度胺(Tocris Bioscience,Missouri,USA)溶于DMSO中，用0.9%Nacl稀釋至1.0 mmol/L作為原液。沙利度胺原液在使用前用DMSO稀釋至所需濃度。TRPV1通道抑制劑(A784168)：購于：上海一飛生物公司；熒光染料Ca2+的熒光染料fluo-4和fura-2購自美國(Invitrogen公司)，實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑生產(chǎn)商提供的方案進(jìn)行，對(duì)照組接受相應(yīng)體積的DMSO注射。

1.5 醋酸扭體試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用“醋酸扭體試驗(yàn)”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疼痛感覺監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格按照“醋酸扭體實(shí)驗(yàn)疼痛模型”[16]。方法為：實(shí)驗(yàn)小鼠在醋酸扭體實(shí)驗(yàn)前1 h腹腔注射沙利度胺(65 mg/kg)；對(duì)照組不注射沙利度胺。然后，以0.2 ml/小鼠的體積注射0.6%的醋酸溶液，計(jì)算30 min內(nèi)小鼠翻滾扭體次數(shù)(腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起呈“S”型，為一個(gè)完整的扭體次數(shù))。

1.6 熱板實(shí)驗(yàn) 采用全自動(dòng)智能溫控?zé)岚鍍x，熱板溫度恒定于(55.0±0.1)℃，將小鼠置于一定溫度的熱板上，熱刺激小鼠足部產(chǎn)生熱痛覺反應(yīng)，以小鼠出現(xiàn)“舔足反應(yīng)”的時(shí)間作用為痛反應(yīng)指標(biāo)，即：痛覺閾值，判斷藥物是否具有鎮(zhèn)痛作用。篩選合格小鼠3只，30 s 內(nèi)有舔后足反應(yīng)者(對(duì)逃避、跳躍者棄之)。并各測(cè)定正常痛閾值1次。用藥后15、30、60 min各測(cè)實(shí)驗(yàn)小白鼠痛閾1次。如60 s鐘仍無反應(yīng)，即將小白鼠取出，以免時(shí)間太久燙傷四肢，其痛閾值為60 s。

1.7 Ca2+熒光成像技術(shù) 培養(yǎng)細(xì)胞HEK293使用fluo-4 Ca2+熒光指示劑(AM)(10 μmol/L) (Invitrogen,USA)，在室溫孵育30 min，然后用PBS溶液洗3次(每次5 min)，待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。辣椒素是TRPV1受體的激動(dòng)劑。當(dāng)細(xì)胞與辣椒素結(jié)合，TRPV1受體被激活，導(dǎo)致陽離子(Ca2+)向內(nèi)流入。熒光信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度直接相關(guān)。在細(xì)胞模型中，將TRPV1過表達(dá)的HEK293穩(wěn)定細(xì)胞接種于96孔板，次日穩(wěn)定的HEK293細(xì)胞接受fluo-4(Ca2+熒光指示劑)處理，然后用不同濃度(0～300 μmol/L)沙利度胺孵育20 min，在FlexStation 3型機(jī)器上(Molecular Devices,USA)每2秒記錄1次細(xì)胞內(nèi)的fluo-4熒光信號(hào)(相對(duì)熒光單位，RFU)。小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)細(xì)胞使用fura-2(AM)(10 μmol/L) (Invitrogen,USA)孵育染色，它是一種用于測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的比值計(jì)量染料，首先將DRG神經(jīng)元接受fura-2(Ca2+熒光指示劑)預(yù)處理，即在室溫孵育細(xì)胞30 min，然后用PBS溶液洗3次(每次5 min)。繼續(xù)采用20或50 μmol/L沙利度胺孵育20 min。細(xì)胞灌注順序?yàn)?.5 μmol/L辣椒素溶液為100 s和氯化鉀溶液(65 mmol/L)60 s。灌注過程中，利用裝載了CCD相機(jī)(Hamamatsu,Japan)的Axiovert 2000型熒光顯微鏡(Carl Zeiss,Germany)，每2秒檢測(cè)fura-2(AM)熒光信號(hào)。Fura-2熒光信號(hào)的發(fā)射光譜隨Ca2+的變化而變化，應(yīng)用F340/F380的比值來確定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。該比值信號(hào)獨(dú)立于fura-2染料濃度、光照強(qiáng)度和光程長度，允許細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度獨(dú)立于這些偽影來最終確定比值。使用Simple PCI 6軟件(Compix Inc,USA)采集熒光圖像并進(jìn)行分析，熒光強(qiáng)度以F340/F380表示，如該產(chǎn)品的生產(chǎn)商設(shè)計(jì)的方案所述，該方案與細(xì)胞內(nèi)相對(duì)Ca2+濃度直接相關(guān)。所有熒光圖像在室溫下拍攝，2次拍攝間隔時(shí)間為2 s。

2 結(jié)果

2.1 沙利度胺可降低HEK293細(xì)胞內(nèi)TRPV1通道活性 添加10 μmol/L辣椒素,TRPV1通道被激活，導(dǎo)致Ca2+流入，Ca2+熒光信號(hào)顯著增加。RFU讀數(shù)大約是320單位。然而,當(dāng)細(xì)胞被3 μmol/L沙利度胺預(yù)處理后,RFU降至約300單位。當(dāng)用高濃度的沙利度胺預(yù)處理時(shí)，熒光信號(hào)進(jìn)一步降低。如在300 μmol/L沙利度胺預(yù)處理下，RFU讀數(shù)下降了約60%(即320～150單位)。與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(沙利度胺濃度：w/o,μmol/L組) 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)論相同。在RFU讀數(shù)被歸一化,并與沙利度胺的濃度相結(jié)合后,計(jì)算出EC 50為26 μmol/L。見表1，圖1、2。

表1 單個(gè)細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光單位(RFU)

圖1 辣椒素激活的TRPV1通道在沙利度胺孵育后的Ca2+變化

2.2 沙利度胺可降低背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元內(nèi)TRPV1通道活性 Fura-2熒光信號(hào)結(jié)果顯示，在KCl溶液處理下，DRG神經(jīng)元均被激活。在沒有沙利度胺孵育的情況下，DRG神經(jīng)元被0.5 μmol/L辣椒素激活(神經(jīng)元1、2、3、4、5)。然而,在50 μmol/L沙利度胺預(yù)處理后,0.5 μmol/L辣椒素溶液無法激活神經(jīng)元(神經(jīng)元6、7、8、9、10)。依次進(jìn)行的3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用了不同批次神經(jīng)元得出了相同的結(jié)論，與對(duì)照組(同時(shí)間點(diǎn)無沙利度胺干預(yù)組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即：在沒有沙利度胺預(yù)處理的情況下對(duì)辣椒素溶液敏感的神經(jīng)元占(62±11)%。然而,在應(yīng)用20～50 μmol/L沙利度胺預(yù)處理的情況下,只有(41±9)%和(28±9)%神經(jīng)元對(duì)辣椒素溶液敏感。見圖3，表2、3。

圖2 將RFUs歸一化并與孵育前使用的沙利度胺的濃度作圖

圖3 細(xì)胞在沒有沙利度胺孵育的情況下，DRG神經(jīng)元被0.5 μmol/L辣椒素激活(神經(jīng)元1、2、3、4、5)。然而,在50 μmol/L沙利度胺預(yù)處理后,0.5 μmol/L辣椒素溶液無法激活神經(jīng)元 (神經(jīng)元6、7、8、9、10)

表2 F340/F380 n=15

表3 氯化鉀敏感細(xì)胞(KCL-sensitive cells)%

2.3 沙利度胺對(duì)野生型小鼠可發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用 我們用TRPV1敲除小鼠模型進(jìn)行醋酸扭體實(shí)驗(yàn)研究其緩解疼痛的作用。在醋酸(0.6%)注射ip前1 h前，腹腔注射沙利度胺(65 mg/kg)，體積0.2 ml/小鼠。然后計(jì)算30 min內(nèi)小鼠扭體的次數(shù)。野生型小鼠經(jīng)沙利度胺預(yù)處理后，平均扭體次數(shù)由原來的54次減少到28次。另外3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表明同樣的結(jié)論，與乙酸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。野生型小鼠經(jīng)沙利度胺預(yù)處理后15 min，平均熱痛覺閾值由原來的26增加到49 s(15 min)；52 s(30 min)；46 s(60 min)，對(duì)照組(野生型WT組)熱痛覺閾值幾乎無變化，另外3組獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4、5。

2.4 沙利度胺對(duì)TRPV1基因敲除小鼠無明顯鎮(zhèn)痛作用 在TRPV1敲除小鼠和使用TRPV1通道抑制劑(A784168)的小鼠中，使用或未使用沙利度胺的小鼠相比，使用TRPV1通道抑制劑的小鼠的扭體數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.5 沙利度胺通過調(diào)節(jié)TRPV1通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用 在TRPV1過表達(dá)的細(xì)胞模型，通過TRPV1通道的陽離子內(nèi)向流入或全細(xì)胞電流通過沙利度胺的預(yù)孵育顯著減少；與HEK293細(xì)胞的結(jié)果一致，在原代DRG神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。同時(shí)，在疼痛動(dòng)物模型中，行為學(xué)結(jié)果提示沙利度胺可緩解野生小鼠疼痛，但對(duì)TRPV1基因敲除小鼠和TRPV1通道抑制劑小鼠無鎮(zhèn)痛作用。同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組與對(duì)照組(野生型WT組) 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4、5。

表4 扭體次數(shù) n=10,次,

表5 熱板實(shí)驗(yàn)

3 討論

20世紀(jì)50年代沙利度胺最先在德國上市，用于治療妊娠期的惡心、嘔吐癥狀的鎮(zhèn)靜藥和鎮(zhèn)痛藥，因其療效顯著而迅速在廣泛使用于全球[17]。但是幾年時(shí)間里，導(dǎo)致全球發(fā)生了極罕見的上萬例海豹肢畸形兒，各國政府紛紛立即禁用沙利度胺。然而，對(duì)沙利度胺的其他作用研究仍在逐步進(jìn)行[9]。近年來，沙利度胺在免疫、抗炎、抗血管生成的藥理臨床研究，在治療麻風(fēng)性結(jié)節(jié)紅斑、重癥肝炎、腫痛、風(fēng)濕病、腫瘤等的研究結(jié)果顯示，沙利度胺是一個(gè)很有應(yīng)用前景的藥物[13]。

TRPV1 基因最初發(fā)現(xiàn)于外周初級(jí)感覺神經(jīng)元中，廣泛分布于哺乳動(dòng)物背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)及外周神經(jīng)末梢的C類神經(jīng)纖維，對(duì)多種理化、溫度、機(jī)械刺激敏感。近年發(fā)現(xiàn)其也在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在大腦對(duì)炎癥疼痛轉(zhuǎn)化及調(diào)節(jié)作用中占重要地位[13,18]。TRPV1對(duì)Ca2+具有高通透性，與配體結(jié)合后激活，導(dǎo)致鈣離子等內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，進(jìn)而引起一系列細(xì)胞內(nèi)生理性或病理性反應(yīng)，最終在疼痛等病理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。TRPV1激活的主要標(biāo)志為陽離子通道開放。通道開放后二價(jià)陽離子(主要是Ca2+)從細(xì)胞外進(jìn)入胞內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。尤其是參與痛覺信號(hào)的傳導(dǎo)，在介導(dǎo)炎性痛、內(nèi)臟痛等多種痛覺方面均起重要作用，是目前研究疼痛機(jī)制與研發(fā)鎮(zhèn)痛藥物的一大熱點(diǎn)[12,20]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有1/5的人口罹患慢性痛，而其中約3/4的患者在病程中伴發(fā)過焦慮、抑郁、精神障礙等精神疾患，關(guān)于慢性疼痛機(jī)制的研究和新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)具有重要意義[15,21]。在介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛和熱痛覺過敏中TRPV1通道的存在和激活起著關(guān)鍵性作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，細(xì)胞培養(yǎng)方面，沙利度胺的預(yù)處理減弱了激動(dòng)劑辣椒素對(duì)TRPV1受體的激活，且這樣的衰減呈劑量依賴性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，在醋酸扭體實(shí)驗(yàn)和熱板實(shí)驗(yàn)中，沙利度胺預(yù)處理可以減輕野生型小鼠疼痛程度，這與先前報(bào)道的沙利度胺具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)的事實(shí)是一致的。同時(shí)，由于沙利度胺對(duì)TRPV1敲除或通道抑制劑小鼠均無鎮(zhèn)痛作用。因此可見，TRPV1受體參與了沙利度胺的鎮(zhèn)痛作用。沙利度胺的鎮(zhèn)痛作用是通過調(diào)控TRPV1通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。TRPV1受體的激活被沙利度胺減弱，從而減輕疼痛。

需要補(bǔ)充的是，沙利度胺需要預(yù)先孵育至少20 min。當(dāng)沙利度胺與辣椒素同時(shí)使用時(shí)，整個(gè)細(xì)胞電流并沒有顯著降低，仍可見陽離子的向內(nèi)流入?？梢酝茢?，沙利度胺本身并沒有直接破壞TRPV1通道與其激動(dòng)劑辣椒素之間的相互作用。沙利度胺的治療減弱了激動(dòng)劑辣椒素對(duì)TRPV1受體的激活，但沒有完全阻斷其通路的開放。

現(xiàn)有研究表明，沙利度胺最嚴(yán)重的不良反應(yīng)是胎兒的致畸作用，其他常見的不良反應(yīng)是劑量依賴性的多發(fā)性神經(jīng)炎，主要表現(xiàn)為手足麻木和感覺異常，其他還有嗜睡、便秘、頭暈和疲倦[8]。值得欣慰的是，當(dāng)前研究通過對(duì)沙利度胺進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造，得到了一系列免疫調(diào)節(jié)藥，克服了原型藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)，自2000年開始進(jìn)行大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，表明這些化合物治療癌癥的潛力，特別是對(duì)于那些很少有藥物可以選擇的癌癥[21]。這些藥物的強(qiáng)大的抗癌作用意味著IMiDs將走出沙利度胺的陰影，成為有效的抗腫瘤藥物[9]。因此，我們重新研究沙利度胺對(duì)TRPV1受體的影響，可能會(huì)對(duì)沙利度胺治療這類復(fù)發(fā)性疼痛和神經(jīng)性疼痛有更多的幫助[6]。

本研究證明，沙利度胺在不同細(xì)胞模型中降低了TRPV1通道的激活；動(dòng)物模型中，沙利度胺發(fā)揮了對(duì)野生小鼠的鎮(zhèn)痛作用，而對(duì)TRPV1基因敲除小鼠和TRPV1受體抑制劑預(yù)處理小鼠無鎮(zhèn)痛作用?？赏茢郥RPV1受體參與了沙利度胺對(duì)小鼠模型的鎮(zhèn)痛作用。TRPV1受體的激活被沙利度胺減弱，而減輕疼痛。