張繼華 米楠楠 崔旭媛 蘇靜 梅文華

在惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移過程中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)起著重要的作用，這一過程是由多個信號傳導途徑觸發(fā)和調(diào)控的，這些信號途徑能夠?qū)毎獾拇碳ぎa(chǎn)生應答而激活。在這些傳導途徑中，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)途徑被認為是最重要的途徑之一[1,2]。以往研究表明SIX1同TGF-β相互作用能偶促進多種惡性腫瘤細胞淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[3]，但他們具體的相互作用機制以及對惡性腫瘤細胞EMT的影響尚不明確，三者在人喉鱗癌中的相互作用仍少見報道。本研究對96例人喉鱗癌患者腫瘤組織及32例腫瘤周圍正常喉黏膜組織中同源異形框基因(SIX1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)以及E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及其 mRNA的表達進行了檢測，旨在探討SIX1、TGF-β在人喉鱗癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及相關作用機制，為臨床喉癌的診治、判斷人喉解癌的轉(zhuǎn)移及預后提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集并整理2015年1月至2017年12月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院收治的96例住院喉鱗狀細胞癌患者標本及病歷資料(患者術前均未經(jīng)放化療)，其中診斷聲門上型患者58例，聲門型患者38例；32例癌旁正常喉黏膜組織取自距離腫瘤切緣≥0.5 cm(病理檢查確認無腫瘤細胞存在)。96例喉鱗癌組織樣本具體情況如下，男79例，女17例；年齡32～76歲，平均(58.6±7.0)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例(T1N1M06例，T1N2M05例，T2N1M08例，T2N2M09例，T3N1M07例，T3N2M02例，T4N1M02例，T4N2M00例)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例(T1N0M014例，T2N0M018例，T3N0M013例，T4N0M012例)；臨床分期：Ⅰ期22例,Ⅱ期28例,Ⅲ期35例，Ⅳ期11例。腫瘤分化程度：高分化45例，中分化16例，低分化35例。所有實驗樣本，經(jīng)病理科兩位副高以上職稱醫(yī)生確認。

1.2 主要試劑與儀器 SIX1免疫組化用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度為1∶75。TGF-β免疫組化用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度均為 1∶55。E-cadherin免疫組化用多克隆抗體，北京奧維亞生物技術有限公司，工作濃度為1∶50。免疫組化用SP染色試劑盒、DAB顯色用試劑，北京中杉金橋生物公司。第一鏈合成cDNA試劑盒，F(xiàn)ermentas 公司。擴增試劑盒GoTaq Green Master Mix，Promega公司。上下游引物，北京奧科生物公司。培養(yǎng)箱：MCO175型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋。倒置顯微鏡X-PC-2型倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色:修剪留取組織標本，常規(guī)脫水、固定、石蠟包埋，蠟塊進行連續(xù)切片，厚度5 μm，SP法(參照說明書)免疫組織化學染色，固定、封片，鏡下判讀組化染色結(jié)果。

1.3.2 結(jié)果判斷:采用半定量雙評分法，顯微鏡高倍鏡視野下根據(jù)陽性細胞所占比例以及細胞染色強度做綜合判定。表達強度評分標準：不著色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。陽性細胞所占視野細胞比例評分標準：陽性細胞百分率<25% ，記0 分；陽性細胞百分率25%～50% ，記1 分；陽性細胞百分率51%～75%，記2分；陽性細胞百分率>75%，記3分。兩種方法所得評分和，0～1為目的蛋白陰性(-)；2為目的蛋白弱陽性(+)；3～4為目的蛋白陽性(++)，5～6為目的蛋白強陽性(+++)。

1.3.3 Western 法測腫瘤細胞內(nèi)SIX1、TGF-β和E-cadherin蛋白表達:參照試劑說明書，提取樣本蛋白，制備Western blot檢測樣品，檢測各組樣品蛋白濃度，常規(guī)上樣，配制選用12%分離膠以及4%濃縮膠，每組樣品上樣量65 μg，同時設置Marker預染蛋白，100 V電泳約85 min，轉(zhuǎn)膜30 V，0.9 mA過夜。洗膜，定影后進行圖像分析。

1.3.4 RT-PCR測定腫瘤組織細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA：Trizol法提取樣本腫瘤細胞總的RNA，檢測各組樣本細胞濃度，確定樣本細胞RNA完整，cDNA反轉(zhuǎn)錄合成，取轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl進行PCR反應。GAPDH，上游 5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’,下游 5’-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’;SIX1：上游5’-CCACTAGAAGAGGAATT-3’，下游5’-CACGCCGGAGCCAAACT-3’，產(chǎn)物大小254 bp，退火溫度56.3℃； TGF-β：上游 5’-CTGTAATTCTGCTGTAATA-3’，下游 5’-GGCTTAGTATTCTGGGAAA-3’，產(chǎn)物大小287 bp，退火溫度54.2℃；Ecadherin:上游 5’-AGGCCAAGCAGCAGTACATT-3’ ，下游5’-ATTCACATCCAGCACATCCA-3’，產(chǎn)物大小為288 bp，退火溫度為56.6℃。反應條件如下：94℃變性1 min，57℃復性1 min，75℃延伸1 min，共設計32個循環(huán)，最后設計75℃延伸10 min。以GAPDH的熒光表達量度作為檢測基因表達參照量。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測SIX1、TGF-β以及E-cadherin蛋白在人喉鱗狀細胞癌及喉正常黏膜組織中的表達 96例人喉癌組織標本中及32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中E-cadherin的陽性表達率分別為21.9%(21/96)和81.3%(26/32)；SIX1的陽性表達率分別為88.5%(85/96)和12.5%(4/32)；TGF-β的陽性表達率分別為86.5%(83/96)和18.8%(6/32)。喉鱗狀細胞癌SIX1、TGF-β陽性表達率均高于癌旁正常黏膜E-cadherin低于癌旁正常黏膜組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，見圖1。

表1 SIX1、TGF-β and E-cadherin蛋白在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達情況 例(%)

A(+++)B(+++)C(+)

2.2 Western Blot檢測SIX1、TGF-β 和E-cadherin蛋白在人喉鱗狀細胞癌及喉正常黏膜組織中的表達 喉鱗狀細胞癌中SIX1、TGF-β蛋白表達明顯高于癌旁正常黏膜，E-cadherin蛋白表達明顯低于癌旁正常黏膜，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 SIX1、TGF-β and E-cadherin在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達情況

2.3 PCR測定人喉鱗癌組織中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA的表達 96例人喉癌組織標本中及32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中E-cadherin的陽性表達率分別為22.9%(22/96)和78.1%(25/32)；SIX1的陽性表達率分別為89.6%(86/96)和9.3%(3/32)；TGF-β的陽性表達率分別為85.4%(82/96)和15.6%(5/32)。喉鱗狀細胞癌SIX1、TGF-β陽性表達率均高于癌旁正常黏膜，E-cadherin陽性表達率低于癌旁正常黏膜，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 SIX1、TGF-β and E-cadherin mRNA在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達情況 例(%)

2.4 SIX1、TGF-β 和E-cadherin蛋白表達與喉鱗癌患者臨床病理特征的關系 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，喉鱗癌組織中SIX1的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)，同時在中低分化患者中SIX1的陽性表達率高于其在高分化患者中的表達(P<0.05)。不同性別、年齡、臨床分期的患者喉癌組織中SIX1的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，喉鱗癌組織中TGF-β的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。不同分化程度的喉鱗癌組織中TGF-β陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義。不同性別、年齡、臨床分期的患者喉癌組織中TGF-β的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，喉鱗癌組織中E-cadherin的陽性表達率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。同時在中低分化患者中，E-cadherin的陽性表達率低于其在高分化患者中的表達(P<0.05)。不同性別、年齡、臨床分期的患者喉癌組織中E-cadherin的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5 Six1、TGF-β和E-cadherin在人喉鱗癌患者腫瘤組織中表達相關性 人喉鱗癌組織中E-cadherin的表達與SIX1表達呈負相關(P<0.05)；E-cadherin的表達與TGF-β表達呈負相關(P<0.05)。見表5。

表5 喉鱗癌組織中Six1、TGF-β和E-cadherin表達的相關性 例

3 討論

EMT是指腫瘤上皮細胞在一定的環(huán)境及相應轉(zhuǎn)化因子等共同因素的相互影響下逐步轉(zhuǎn)變成充質(zhì)細胞的現(xiàn)象[4]。目前多數(shù)學者認為EMT是惡性腫瘤生長、轉(zhuǎn)變的過程之一，同惡性腫瘤細胞的局部浸潤及遠處淋巴轉(zhuǎn)移緊密相關。EMT轉(zhuǎn)化的過程主要表現(xiàn)為，原腫瘤上皮細胞極性逐漸消失，上皮細胞及其與其周圍其他細胞的接觸相應減少，細胞間的連接，包括黏附連接及緊密連接減少，使得細胞脫離的機會增加，易于發(fā)生局部浸潤及發(fā)生遠處遷移，EMT的發(fā)生會出現(xiàn)原有上皮細胞表型的轉(zhuǎn)變，其上皮表型如E-eadherin、角蛋白絲等消失，間質(zhì)表型，纖維連接蛋白，N-鈣粘素等逐漸形成。其中代表細胞間黏附力的E-cadherin表達下降是ENT的主要表現(xiàn)，也被視為EMT轉(zhuǎn)化的標志[5]。實驗研究表明，EMT同腫瘤細胞向局部浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移的過程密切相關，EMT可誘導多種惡性腫瘤細胞局部侵潤和淋巴轉(zhuǎn)移，比如卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌及惡性黑色素瘤等[6-9]。因此，EMT被認為是多種上皮來源腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標志。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程是由多個信號傳導通路觸發(fā)和調(diào)控的，在這些信號傳導通路中，TGF-β被認為是最重要的途徑之一[10]。TGF-β能夠通過MAPK (mitogen-activated protein kinases)通路、SMAD通路及Wnt通路等途徑對腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)，在大腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中均存在TGF-β的高表達[11]，其表達強度與腫瘤的分化、淋巴轉(zhuǎn)移及預后密切相關[12]。以往的研究證實，TGF-β能夠被細胞中的多種活性因子激活，并與這些因子共同作用，激活及影響細胞內(nèi)多種傳導通路，但腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄因子的高表達能否增強TGF-β途徑在誘導人喉鱗癌EMT過程中的作用尚不清楚。

SIX1是一種成熟相關的細胞因子，在發(fā)育成熟的細胞內(nèi)很少表達，然而最近研究表明，SIX1在多種惡性腫瘤組織中卻呈現(xiàn)出高表達，SIX1能夠影響Cyclin A1、Cyclin D1及Ezrin等多種下游編碼基因的表達[13-16]。SIX1在卵巢癌、乳腺癌、肝細胞癌等多種惡性腫瘤中表達強度同腫瘤的預后密切相關[12-14]。最近研究證明，SIX1 能夠與TGF-β共同作用，并通過SMAD2/3途徑調(diào)節(jié)VEGF等多種基因的表達，進而發(fā)揮其促進腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移功能，基于以上研究結(jié)果，本研究的目的在于，探討SIX1與TGF-β是否在人喉鱗癌EMT的過程中起著促進作用。

研究表明， SIX1能夠同TGF-β共同作用促進腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進一步提高腫瘤細胞局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移的能力[17]。本研究結(jié)果顯示，Six1、TGF-β蛋白在人喉鱗癌組織中均出現(xiàn)了陽性表達，同癌周正常黏膜相比出現(xiàn)了明顯的增強，提示Six1、TGF-β同喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。同時研究結(jié)果顯示，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Six1、TGF-β蛋白的陽性表達率明顯升高，同無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比差異有統(tǒng)計學意義，同時，E-cadherin陽性表達率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中出現(xiàn)了降低，同無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相關性研究結(jié)果顯示，Six1、TGF-β的表達與E-cadherin表達呈負相關(P<0.05)，提示， SIX1及TGF-β可能是調(diào)節(jié)喉鱗癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要影響因子，二者的高表達可能共同促進了喉鱗癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制了E-cadherin蛋白的表達，進而促進人喉鱗狀細胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時PCR測定人喉鱗癌組織中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA的表達結(jié)果顯示人喉癌組織標本及瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中E-cadherin mRNA的陽性表達率同其蛋白的陽性表達率基本一致，說明上述表達變化發(fā)生在基因表達水平。

本課題對SIX1、TGF-β在人喉鱗癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用做了初步探討。結(jié)果提示，SIX1和TGF可能成為抑制喉鱗癌EMT發(fā)生的重要因素，聯(lián)合檢測SIX1、TGF-β及E-cadherin對判斷人喉鱗癌的轉(zhuǎn)移及預后有重要臨床意義。