何智慧 黃麗 蘇菊紅 劉峰

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球肺癌的發(fā)病率和病死率均呈上升態(tài)勢，尤其在中國等發(fā)展中國家[1,2]。晚期肺癌傳統(tǒng)化療的療效有限，預(yù)后仍不容樂觀，中位生存時間僅為8～10個月，1年生存率僅在40%左右[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)結(jié)合，抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。miR-4286位于人染色體8p23.1位點，已有研究證明miR-4286參與食管鱗癌[5]和胰腺癌[6]的調(diào)節(jié)。在肺癌細(xì)胞中miR-4286呈高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)[7]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子是叉頭框(Forkhead box,FOX)家族中的一員，通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、分化等過程[8]。FOXO4是FOXO亞家族中的成員，在胃癌、大腸癌中的表達(dá)都有所下調(diào)或缺失，表明多種機制導(dǎo)致的FOXO4失活可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9,10]。本研究通過觀察miR-4286在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其是否通過調(diào)控FOXO4表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，以期為肺癌細(xì)胞的靶向分子治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE(美國ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、MTT試劑(美國Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素混合液(美國Abcam公司)；LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Intvitrogen公司)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；WT-FOXO4和MUT-FOXO4熒光素酶重組載體質(zhì)粒(上海生工生物工程有限公司)；熒光素酶報告檢測試劑盒(美國Promega公司)；FOXO4過表達(dá)重組載體質(zhì)粒及空載質(zhì)粒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；CyclinD1、P21、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9單抗及HRP標(biāo)記的二抗(英國Abcam公司)；Transwell小室(美國Coring公司)；細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒、超敏ECL發(fā)光試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，放置在37℃、飽和濕度、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2天換液，待細(xì)胞生長匯合率至80%以上時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取指數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實驗研究。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 生長狀態(tài)良好的肺癌A549細(xì)胞接種到6孔板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%時，使用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑將anti-miR-4286或陰性對照anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。將轉(zhuǎn)染anti-miR-4286的A549細(xì)胞命名為anti-miR-4286組，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的A549細(xì)胞命名為anti-miR-NC組，2組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h行RT-qPCR檢測。

1.4 RT-qPCR實驗 收集對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染48 h 2組A549細(xì)胞，使用Trizol試劑分別抽提總RNA，純化RNA，并使用分光光度計檢測RNA樣品的純度和豐度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒行qPCR檢測，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μl、2×SYBR Green Mix 10 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、ddH2O 6 μl。反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；隨后95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 10 s循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參檢測細(xì)胞中miR-4286的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參檢測細(xì)胞中FOXO4的表達(dá)水平。所用引物序列：miR-4286上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGACCCCACTCCT-3’；下游引物5’-TACCAGGAGTGGGGTTT-3’。U6上游引物5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’；下游引物5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’。 FOXO4上游引物：5’-CCGGCAAAAGCTCTTGGTG-3’；下游引物5’-GGTCCACATATCGGCTTCTTCA-3’。 GADPH上游引物5’-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3’；下游引物5’-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3’。反應(yīng)結(jié)束后分別獲得目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用相對定量2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。實驗獨立重復(fù)3次。

1.5 MTT實驗 對數(shù)期的A549細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞匯合率至50%時按照1.3進(jìn)行轉(zhuǎn)染，anti-miR-NC組、anti-miR-4286組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時，向每孔細(xì)胞加入20 μl MTT溶液，隨后放置在37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸取細(xì)胞上清液，再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻后放置到震蕩儀上反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(A值)，分別計算三組A549細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。實驗獨立重復(fù)3次。

1.6 Transwell實驗 轉(zhuǎn)染后3組A549細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，饑餓處理24 h，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個/ml，取200 μl細(xì)胞懸液接種到Matrigel膠預(yù)先包被的Transwell小室的上室，在小室下層添加500 μl含10%血清的培養(yǎng)液，放置在37℃常規(guī)培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育48 h。取出小室，用濕潤的棉簽擦去上層未穿過基底膜的細(xì)胞，用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)，實驗重復(fù)3次，統(tǒng)計3組A549細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.7 Western blot實驗 使用細(xì)胞裂解液分別提取轉(zhuǎn)染48 h 3組A549細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒對蛋白樣品進(jìn)行濃度測定并調(diào)平。配制10%的SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白上樣，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。實驗5%脫脂奶粉室溫封阻2 h，洗膜并加入相應(yīng)一抗，根據(jù)說明書將CyclinD1、P21一抗1∶600稀釋，MMP-2和MMP-9一抗1∶800稀釋，4 ℃過夜孵育。第2天洗膜后再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加超敏ECL顯色液，在暗室顯影曝光，采集圖像，使用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次。

1.8 熒光素酶報告實驗 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，F(xiàn)OXO4的3’UTR與miR-4286的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點。PCR擴增含miR-4286結(jié)合位點的FOXO4的3’UTR序列，插入pmirGLO報告基因載體，構(gòu)建FOXO4野生型載體(WT-FOXO4)?；蛲蛔兗夹g(shù)將結(jié)合位點突變后，同樣插入pmirGLO報告基因載體，構(gòu)建FOXO4突變型載體(MUT-FOXO4)。分別將WT-FOXO4、MUT-FOXO4與miR-4286(模擬物)mimic或陰性對照共轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。實驗獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-4286和FOXO4在肺癌細(xì)胞中的表達(dá) 與正常支氣管上皮細(xì)胞HBE組比較，肺癌細(xì)胞A549組中miR-4286表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)OXO4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 miR-4286和FOXO4在肺癌組織中的表達(dá)

2.2 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-4286組miR-4286表達(dá)、細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，P21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 增殖相關(guān)蛋白

表2 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-4286組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3,圖2。

表3 抑制miR-4286對肺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

圖2 遷移和侵襲相關(guān)蛋白

2.4 上調(diào)FOXO4對肺癌細(xì)胞增殖的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-FOXO4組細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)OXO4 mRNA和P21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表4,圖3。

圖3 增殖相關(guān)蛋白

表4 上調(diào)FOXO4對肺癌細(xì)胞增殖的影響

2.5 上調(diào)FOXO4對肺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-FOXO4組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4,表5。

表5 上調(diào)FOXO4對肺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

圖4 遷移和侵襲相關(guān)蛋白

2.6 miR-4286靶向FOXO4 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，F(xiàn)OXO4的3’UTR含有與miR-4286結(jié)合的連續(xù)位點。與miR-NC組比較，miR-4286組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FOXO4的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染MUT-FOXO4的細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，說明miR-4286可與FOXO4的3’UTR靶向結(jié)合。miR-4286組FOXO4的mRNA表達(dá)水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-4286組FOXO4的mRNA表達(dá)水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)，進(jìn)一步說明miR-4286靶向負(fù)調(diào)控FOXO4表達(dá)。見圖5，表6、7。

圖5 miR-4286靶向調(diào)控FOXO4

表6 雙熒光素酶報告實驗

表7 miR-4286調(diào)控FOXO4的表達(dá)

2.7 抑制FOXO4能逆轉(zhuǎn)干擾miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與anti-miR-4286+si-NC組比較，anti-miR-4286+si-FOXO4組細(xì)胞存活率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)OXO4 mRNA、P21蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6，表8。

表8 抑制FOXO4能逆轉(zhuǎn)干擾miR-4286對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖6 增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白

3 討論

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)已居惡性腫瘤類疾病的第1位[11]，而在我國惡性腫瘤疾病的死亡原因中也居首位，約占到全部惡性腫瘤病死率的22.7%，并且其發(fā)病率正以每年26.9% 的速度增長，如果不能進(jìn)行有效的控制，預(yù)計到2025年，我國將成為世界第一肺癌大國[12]，因此研究肺癌的治療方案是當(dāng)今亟待解決的難題。

miR-4286早前已經(jīng)被證實在腫瘤發(fā)生進(jìn)展過程中起到重要作用。趙華等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4286在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。miR-4286 的陽性染色定位于NSCLC癌組織、癌旁正常組織的胞質(zhì)或細(xì)胞核，染色呈紅色至深紫色。趙琳等[14]研究表明，miR-4286在前列腺癌中具有良好的診斷價值，可作為新型的液體活檢標(biāo)志物。

據(jù)郭紅艷等[15]報道，miR-4286在胃癌血清中高表達(dá)，其表達(dá)水平與病理分化程度有關(guān)，可能成為胃癌臨床診斷的潛在指標(biāo)。miR-4286 通過靶向INPP4A基因激活JAK2/STAT3信號通路，促進(jìn)食管癌的發(fā)生，與食管癌患者的預(yù)后生存期高風(fēng)險密切相關(guān)，有望成為食管癌治療的靶點[16,17]。本研究表明，miR-4286在肺癌中的表達(dá)比較高。

已知作為抑癌基因的FOXO4，不僅參與阻滯腫瘤細(xì)胞周期，還通過多種途徑參與細(xì)胞凋亡過程。已經(jīng)有研究表明，F(xiàn)OXO4在NSCLC中低表達(dá)，其可作為抑癌基因[18]；miR-96介導(dǎo)FOXO3表達(dá)變化促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡并抑制肺癌細(xì)胞增殖[19]。FOXO4在胃癌中的增殖、凋亡、感染關(guān)系和預(yù)后關(guān)系中發(fā)揮重要作用[20-23]；FOXO4在大腸癌中表達(dá)明顯降低或缺失，且在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑癌基因的作用[24]；通過研究發(fā)現(xiàn)FOXO4蛋白在結(jié)腸直腸組織中的差異表達(dá)，癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[25]；FOXO4能夠促進(jìn)人喉癌細(xì)胞凋亡，抑制喉癌細(xì)胞增殖，作用機制與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[26]；miR-421下調(diào)FOXO4可以增強鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的放療敏感性[27]。本研究表明，F(xiàn)OXO4在肺癌中的表達(dá)比較低。

綜上所述，miR-4286在肺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，抑制其表達(dá)可降低肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其通過靶向下調(diào)FOXO4表達(dá)發(fā)揮作用，miR-4286/FOXO4軸為肺癌的靶向分子治療提供了新思路。