陳瑞媛，張森，張子涵，李文鑫，廖存

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結直腸肛門外科 廣西南寧530021

結直腸癌（CRC）是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，死亡率位居惡性腫瘤前列[1]。有學者根據(jù)時間和人口分布進行預測認為，2030年CRC的全球負擔將增加60%，新發(fā)病例將超過220萬，死亡病例將達110萬[2]。CRC的治療手段包括手術、放療、化療等，對于確診時無遠處轉(zhuǎn)移的患者，手術切除可獲得良好的臨床療效，但5年中位總生存率僅為66.4%[3]。近年來，CRC腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境（TME）的相互作用逐漸引起國內(nèi)外研究者關注，通過免疫檢查點抑制劑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)是一種新興的治療方法，細胞程序性死亡受體-1（PD-1）和細胞程序性死亡受體-配體1（PD-L1）是常用靶點[4]，其中PD-1抑制劑帕姆單抗（pembrolizumab）已被批準用于治療微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）或錯配修復缺陷（dMMR）的轉(zhuǎn)移性CRC（mCRC）[5]。但抗PD-1/PD-L1免疫治療僅對2.5%～5%的mCRC患者（MSIH或dMMR）有效，大部分微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）患者對抗PD-1/PD-L1免疫治療無明顯反應[6]。

Chen等[7]的研究結果提示，根據(jù)接受PD-1抑制劑治療患者的臨床療效和免疫表型可以將腫瘤的免疫微環(huán)境分為三種基本類型：免疫不敏感型、免疫排斥型和免疫惡化型?；诖朔诸?，PD-1抑制劑的有效性不僅取決于腫瘤內(nèi)PD-L1的表達，還取決于腫瘤微環(huán)境中是否存在足夠的免疫效應細胞，其中腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）CD4+和CD8+引起了學者們的關注[8]。此外，有研究提示促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素6（IL-6）可誘導腫瘤細胞PD-L1的表達[9]，幫助實現(xiàn)免疫逃逸。本研究旨在探討CRC患者癌組織PD-L1的表達及其與腫瘤微環(huán)境的關系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年10月至2020年2月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結直腸肛門外科收治的80例CRC患者為研究對象?；颊咂骄挲g（54.4±11.6）歲，其中男性41例、女性39例，結腸癌43例、直腸癌37例，腫瘤病理分期Ⅰ期12例、Ⅱ期32例、Ⅲ期23例、Ⅳ期13例，分化程度為低分化15例、中分化44例、高分化21例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準實施（2018-KY-國基-141），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）符合CSCO結直腸癌診療指南（2019版）Ⅰ～Ⅳ期診斷標準的患者；（2）初診患者，并非多原發(fā)癌，接受根治性手術，術前未接受新輔助放化療。排除標準：（1）術后無明確病理結果；（2）臨床資料不完整。

1.3 方法

1.3.1 試驗取材 于患者入院次日清晨抽取空腹8 h外周靜脈血3～5 mL置于5 mLEDTA抗凝管中，用于實驗室檢測；于手術當日取患者癌組織標本1 cm3并于30 min內(nèi)以10%甲醛固定，用于病理學檢測。

1.3.2 實驗方法 （1）免疫組化：將石蠟切片分別經(jīng)脫蠟、抗原修復、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、封閉、一抗孵育（PD-L1抗體購自T英國Abcam公司，CD4+、CD8+抗體購自北京中杉金橋公司）、二抗孵育、顯色、復染、晾干封片等步驟后于顯微鏡下觀察癌組織中PD-L1、CD4+TIL、CD8+TIL表達情況，并以Image Pro Plus軟件分析表達量。（2）酶聯(lián)免疫吸附法：將患者抗凝外周血4 000 r離心5 min取血清，以ELISA試劑盒（購自美國SAB公司）測定外周血清TNF-α、IL-6水平。

1.3.3 臨床數(shù)據(jù)收集 收集患者腫瘤病理分期、分化程度資料。

1.4 觀察指標

（1）癌組織中PD-L1的表達情況。將切片分為5個視野，計算平均每個視野陽性細胞比例，按比例高低分為4個等級（自擬），其中：無表達為陰性，表達率<20%為弱陽性，表達率20%～50%為陽性，表達率>50%為強陽性。記錄不同等級的占比。（2）分析不同腫瘤病理分期、分化程度結直腸癌的PDL1表達量差異。（3）分析PD-L1不同表達強度的血清TNF-α水平、IL-6水平、癌組織中CD4+TIL表達量、CD8+TIL表達量差異。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以M（QL，QU）表示，采用非參數(shù)檢驗比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癌組織中PD-L 1的總體表達情況

在80例癌組織標本中，PD-L1陰性表達24例（30%）、弱陽性表達27例（33.8%）、陽性表達15例（18.8%）、強陽性表達14例（17.5%）。不同表達強度的PD-L1表達情況如圖1。

圖1 PD-L 1表達強度的表達情況（×40）

2.2 不同腫瘤病理分期及分化程度結直腸癌的PDL 1表達量比較

不同腫瘤病理分期、分化程度結直腸癌的PDL1表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。見表1。

表1 不同腫瘤病理分期及分化程度結直腸癌的PD-L 1表達量比較 M（QL，QU）

2.3 PD-L 1不同表達強度的癌組織中CD 4+TIL及CD 8+TIL表達量比較

PD-L1不同表達強度的癌組織中CD4+TIL表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。PD-L1不同表達強度的癌組織中CD8+TIL表達量比較差異有統(tǒng)計學意義，PD-L1強陽性表達組癌組織中CD8+TIL表達量高于PD-L1陰性表達組、弱陽性表達組，PD-L1陽性表達組癌組織中CD8+TIL表達量高于PD-L1弱陽性表達組（均P<0.05）。見表2。

表2 PD-L 1不同表達強度的癌組織中CD 4+TIL及CD 8+TIL表達量比較 M（QL，QU）

2.4 PD-L 1不同表達強度的血清TNF- α及IL- 6水平比較

PD-L1不同表達強度的血清TNF-α及IL-6水平比較差異均有統(tǒng)計學意義，PD-L1強陽性表達組血清TNF-α水平高于PD-L1陰性表達組、陽性表達組，PD-L1強陽性表達組、陽性表達組血清IL-6水平均高于PD-L1陰性表達組、弱陽性表達組（均P<0.05）。見表3。

表3 PD-L 1不同表達強度的血清TNF- α及IL- 6水平比較 pg/mL，M（QL，QU）

3 討論

PD-1是B7/CD28家族成員之一，在CD4+T細胞、CD8+T細胞、單核細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、樹突狀細胞等細胞中表達，其兩個配體分別為程序性死亡配體1（PD-L1，也稱為B7-H1或CD274）和程序性死亡配體2（PD-L2，也稱為B7-DC或CD273）。PD-L1可見表達于多種實體惡性腫瘤，比如頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌、結直腸癌[10]。當PD-L1與PD-1結合時，T細胞活化的負反饋回路受到抑制，針對癌細胞而產(chǎn)生的細胞毒性T細胞增殖效應減弱，腫瘤借此逃避免疫監(jiān)視得以進一步生長或轉(zhuǎn)移[11]。Li等[12]開展的一項Meta分析納入了2 131例CRC患者，根據(jù)這些患者的檢測結果發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達情況與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期等無關，與腫瘤分化程度有關，但本研究結果未提示腫瘤病理分期、分化程度與PD-L1表達量有關，這可能與單中心來源樣本有關。

有報道認為，PD-L1的表達情況可作為癌癥患者預后的獨立預測因子[13]。但近年來也有學者對“PD-L1高表達預示著CRC患者不良結局”這一說法提出了爭議，因為有研究得出了相悖的結論[14]，這些研究得出不同結論的原因可能是由于細胞免疫與免疫逃逸之間的復雜作用關系。Lin等[15]基于CD8+TIL密度及PD-1/PD-L1表達量對非小細胞肺癌患者進行分組研究，發(fā)現(xiàn)癌組織高CD8+TIL密度和低PD-1/PD-L1表達量的患者獲得了最佳生存結局。本研究在檢測癌組織PD-L1表達情況的同時檢測CD4+TIL、CD8+TIL表達量，發(fā)現(xiàn)CD8+TIL表達量與PD-L1表達量有關，其中可觀察到PD-L1強陽性表達組CD8+TIL表達量高于PD-L1陰性表達組。這些研究結果提示我們在評估CRC患者接受抗PD-1/PD-L1免疫預期獲益時亦應可將TILs表達情況納入考慮。

本研究中CRC患者血清TNF-α、IL-6水平與PD-L1表達量有關，其中可觀察到PD-L1強陽性表達組血清TNF-α、IL-6水平均高于PD-L1陰性表達組。Ju等[9]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤巨噬細胞可釋放促炎細胞因子TNF-α和IL-6，誘導癌細胞PD-L1的表達，并通過激活了NF-κB和STAT3信號通路調(diào)節(jié)PD-L1的表達。Li等[16]在對肥胖小鼠開展的研究中發(fā)現(xiàn)其腫瘤細胞PD-L1表達量升高，脂肪細胞可分泌TNF-α和IL-6進而上調(diào)PD-L1表達，使用抗TNF-α和抗IL-6抗體可對該過程產(chǎn)生負性作用。腫瘤微環(huán)境對抗PD1/PD-L1免疫治療效果的影響作用是復雜的，我們在為患者制定治療方案時應適當綜合評估腫瘤微環(huán)境，TNF-α和IL-6水平不失為可選擇的考慮因素。

綜上所述，CRC患者癌組織檢出PD-L1表達陽性率較高，CRC患者血清TNF-α、IL-6水平及癌組織中CD8+TIL表達量與癌組織中PD-L1表達量有關。腫瘤微環(huán)境對抗PD1/PD-L1免疫治療效果的影響有待進一步探討。