陳海，李紅燕，王建，謝倩，付尹

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137)

腦卒中(中醫(yī)名中風(fēng))是由于腦部供血不足或出血而引起的一種臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[1]，且具有逐步年輕化的趨勢(shì)，是我國(guó)成年人致死、致殘的首位病因[1]。腦卒中可分為缺血性卒中和出血性卒中，其中，缺血性卒中為腦卒中的主要類型，約占全部腦卒中70%[2]。牛黃為?？苿?dòng)物牛(BostaurusdomesticusGmelin)的干燥膽囊或膽管結(jié)石，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主驚厥，寒熱，熱盛狂痓?！侗静菥V目》中記載：痘瘡紫色，發(fā)狂譫語(yǔ)者可用。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中記載其功效為清心、豁痰、開(kāi)竅、涼肝、息風(fēng)、解毒，可用于治療熱病神昏，中風(fēng)痰迷，驚厥抽搐，癲發(fā)狂。可見(jiàn)牛黃自古以來(lái)就用于中風(fēng)、癲狂、驚厥等各種病證的治療，然其作用分子機(jī)制不明。利用“一種藥物、一個(gè)靶標(biāo)、一種疾病”的傳統(tǒng)藥理學(xué)的模式很難快速發(fā)現(xiàn)新的作用靶點(diǎn)。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)牛黃治療缺血性腦卒中的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)，為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 數(shù)據(jù)來(lái)源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、PubChem Compound-NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)、swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//labworm.com/tool/swisstargetprediction)、uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//auth.lifemapsc.com/)、DisGeNET基因-疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.disgenet.org/search)、cytoscape3.7.1可視化軟件、omicshare資源共享平臺(tái)(http：//www.omicshare.com/)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.kegg.jp/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/)、String數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)。

1.2方法

1.2.1牛黃化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 根據(jù)2015版《中華人民共和國(guó)藥典》和在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[檢索條件：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18]中檢索結(jié)果，牛黃的有效成分確定為膽酸、膽紅素、去氧膽酸、膽固醇、豬去氧膽酸、牛磺酸、去氧膽酸甲酯和戊酸鹽。

1.2.2牛黃活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選 PubChem Compound-NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索牛黃各有效成分的Canonical SMILES；根據(jù)Canonical SMILES式在swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中查找牛黃各有效成分的作用靶點(diǎn)，繪制成分-靶點(diǎn)互作圖；在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中找出各個(gè)靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，繪制蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)圖。

1.2.3缺血性腦卒中靶點(diǎn)篩選 在DisGeNET基因-疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)(檢索條件：score-gda>0.01)和Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)(檢索條件：relevance score≥10)中查找缺血性腦卒中(C0948008)的靶點(diǎn)。

1.2.4成分-疾病共同作用的靶點(diǎn)篩選 匯總牛黃各成分與缺血性腦卒中共同作用的靶點(diǎn)，在uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中確定共同靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的靶基因。

1.2.5功能富集與通路富集 將牛黃的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，Select Identifier設(shè)置為OFFICIAL GENE SYMBOL，List Type設(shè)置為Gene List，限定物種為人，對(duì)牛黃作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析；在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中利用KEGG Mapper進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1牛黃活性成分的作用靶點(diǎn) 將牛黃的主要活性成分依次在swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其作用靶點(diǎn)，為提高檢索精確度，選取每種成分Top15的作用靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 牛黃活性成分作用靶點(diǎn)列表

將牛黃的活性成分與作用靶點(diǎn)，在cytoscape3.7.1中進(jìn)行可視化操作，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將牛黃的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，獲取PPI圖，見(jiàn)圖2。其中，圓點(diǎn)代表該基因編碼的所有蛋白質(zhì)；連線表示蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白的連線越密集、顏色越豐富，提示其在PPI該網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。從該網(wǎng)絡(luò)圖可以看出：CYP19A1、AR、CASP3、CYP51A1、ESR1、ESR2等蛋白的連線密集，說(shuō)明其在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中所起的作用較大。

圖2 牛黃活性成分作用的靶點(diǎn)互作圖(PPI圖)

2.3活性成分-疾病共同作用的靶點(diǎn) 除去牛黃活性成分間重復(fù)作用的靶點(diǎn)，整理后得到牛黃的作用靶點(diǎn)60個(gè)；檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET基因--疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)，分別得到127個(gè)和201個(gè)靶點(diǎn)，除去重復(fù)作用的靶點(diǎn)，整理后共得到缺血性腦卒中靶點(diǎn)260個(gè)。牛黃和缺血性腦卒中兩者共同作用的靶點(diǎn)8個(gè)，在uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中確定共同靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因，分別為：HMGCR、PPARA、CYP2C19、ESR1、ESR2、MMP1、MAPT、CASP3。

2.4GO功能富集 GO功能富集可分為分子功能(molecular function)、生物過(guò)程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)三個(gè)部分。其中分子功能涉及到催化活性、分子功能調(diào)節(jié)等過(guò)程；生物過(guò)程涉及到細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、對(duì)刺激的反應(yīng)、代謝過(guò)程以及生物調(diào)節(jié)等過(guò)程；細(xì)胞過(guò)程涉及到細(xì)胞器、細(xì)胞膜等(圖3)。GO功能富集的柱狀圖(圖4)和氣泡圖(圖5)可以看出，TOP5的富集結(jié)果分別是甾體激素的代謝過(guò)程、甾體激素的生物合成過(guò)程、內(nèi)部刺激的反應(yīng)、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)以及激素的代謝過(guò)程。

圖3 牛黃作用靶點(diǎn)GO功能富集圖

圖4 GO功能富集柱狀圖

圖5 GO功能富集氣泡圖

2.5KEGG通路富集 將牛黃作用的靶基因進(jìn)行KEGG通路富集，得到的TOP 5的KEGG通路見(jiàn)表2。

表2 TOP5的KEGG通路富集結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中后腦損傷的機(jī)制異常復(fù)雜，病理過(guò)程涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、凋亡等方面[3]。牛黃作為豁痰開(kāi)竅的良藥，臨床常用于治療中風(fēng)(缺血性腦卒中)，然而其分子機(jī)制不明。

傳統(tǒng)藥物靶點(diǎn)的研究是以個(gè)別分子為研究對(duì)象，采用多種手段研究其生物學(xué)性質(zhì)。這種孤立靶點(diǎn)的研究很難對(duì)靶點(diǎn)的功能進(jìn)行系統(tǒng)全面的認(rèn)識(shí)。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)性和完整性為特征，可以更快、更準(zhǔn)確、更全面地預(yù)測(cè)藥物的作用靶點(diǎn)。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)牛黃和缺血性腦卒中共同作用的靶點(diǎn)有8個(gè)，其中CASP3、ESR1、ESR2、CYP2C19、HMGCR等5個(gè)在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中處于核心位置，提示以上5個(gè)靶點(diǎn)是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

Caspase蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其激活與過(guò)表達(dá)可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase3處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，它被系列反應(yīng)激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[4-5]。研究表明體外培育牛黃可通過(guò)抑制Caspase3的激活、減少細(xì)胞凋亡而治療由DSS誘導(dǎo)的慢性潰瘍性結(jié)腸炎[6]。而Caspase3在啟動(dòng)和執(zhí)行由腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡方面也發(fā)揮重要作用，它可放大蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。ESR1和ESR2分別編碼雌激素受體的兩個(gè)亞型ERα和ERβ，它們與雌激素結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)體外培育牛黃可減少肝臟內(nèi)ERα的表達(dá)，從而減輕雌激素誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝組織病理?yè)p傷[8]。

雌激素與受體結(jié)合后對(duì)去卵巢局灶性腦缺血模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，而ESR1參與神經(jīng)保護(hù)和認(rèn)知修復(fù)過(guò)程[9]。膽固醇是合成甾體激素的原料，也是細(xì)胞膜的關(guān)鍵組成部分。許多生物學(xué)功能如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、吞噬、細(xì)胞膜代謝等均需要膽固醇參與。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)則參與膽固醇的合成，且是膽固醇合成途徑的限速酶[10]。

GO功能富集分析和KEGG通路富集的結(jié)果顯示牛黃治療缺血性腦卒中與甾體激素的生物合成、代謝通路、神經(jīng)活性配體——受體相互作用有關(guān)。研究表明[11-12]牛黃可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)、減少一氧化氮(NO)和自由基產(chǎn)生、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等途徑改善大鼠腦缺血-再灌注損傷。膽紅素作為牛黃有效成分之一，能夠提高缺血缺氧性腦損傷大鼠的認(rèn)知功能，抑制海馬組織細(xì)胞凋亡[13]，且可通過(guò)降低腦組織Caspase3的表達(dá)水平，阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡程序，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。

甾體激素(包括雌激素、孕激素、雄激素和腎上腺皮質(zhì)激素)也被證明對(duì)缺血性腦卒中具有改善作用。

雌激素可通過(guò)MAPK途徑減少線粒體Ca2+的內(nèi)流、保護(hù)線粒體免受損傷，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元[15]；還可以增加腦內(nèi)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)，提高NO利用率以促血管舒張、增加腦血流量，保護(hù)缺血性腦損傷[16]。孕激素可通過(guò)影響PKCβⅡ和NF-κB p65及IP3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用[17]。關(guān)于雄激素對(duì)缺血性腦卒中的影響，目前尚存在一定的爭(zhēng)議。龍艷芳等[18]研究表明生理水平的雄激素可通過(guò)減少細(xì)胞色素C(cyt-c)的表達(dá)，從而保護(hù)缺血-再灌注引起的腦損傷。王國(guó)英[19]則發(fā)現(xiàn)丙酸睪酮會(huì)加重腦缺血-再灌注所致的神經(jīng)功能缺損和細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與促進(jìn)Bax表達(dá)和減少Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

甾體激素的生物合成與牛黃的作用靶點(diǎn)CYP11、CYP17、CYP19等有關(guān)。合成甾體激素的原料——膽固醇在CYP11A的催化下轉(zhuǎn)變成為孕烯醇酮；孕烯醇酮在17A-羥化酶(CYP17A)作用下生成17A-羥孕烯醇酮；17-A羥孕烯醇酮在17，20碳鏈裂解酶、17-HSD、3-HSD作用下轉(zhuǎn)變成雄激素；雄激素在芳香化酶(CYP19)的催化下轉(zhuǎn)化為雌二醇和雌酮[20]。

以上結(jié)果提示牛黃、缺血性腦卒中與甾體激素三者之間關(guān)系密切，這與GO功能富集分析和KEGG通路富集的結(jié)果是一致的。

綜上所述，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)牛黃可能通過(guò)靶向HMGCR、CYP2C19、ESR1、ESR2、CASP3、CYP11、CYP17、CYP19等8個(gè)關(guān)鍵蛋白及甾體激素的生物合成、代謝通路以及神經(jīng)活性配體-受體而起作用，為研究缺血性腦卒中的治療提供新的治療靶點(diǎn)。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)論只是在大數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上所做的推測(cè)，且結(jié)論也受所選數(shù)據(jù)庫(kù)的限制，因此本研究的結(jié)論還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。