管怡晴，陳凱，田元新，全東令，張靜茹，呂琳，張國華

(南方醫(yī)科大學1.中醫(yī)藥學院；2.藥學院，廣州 510515)

“黃芩-槐花”藥對是張國華教授在多年臨床實踐中，用于治療高血壓的常用配伍組合，其臨床降壓療效明確，然而目前關(guān)于“黃芩-槐花”配伍組合對高血壓作用機制的研究筆者尚未見報道，因此，筆者在本研究探討其對高血壓作用的潛在機制，為臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。

黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科多年生草本植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，其味苦、性寒，具有清熱燥濕、止血安胎、瀉火解毒等功效[1]。黃芩主要含有黃酮及其苷類，如黃芩苷、黃芩素、白楊素等[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芩苷在治療高血壓、減少心臟膠原沉積并改善心臟重構(gòu)、改善胰島素敏感性等方面有明顯效果[3-5]。白楊素具有降壓、改善心肌損傷、糖尿病腎病[6-8]等作用。黃芩素可通過抗氧化應(yīng)激、抑制蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)及多元醇通路的激活、抑制炎癥遞質(zhì)、降壓、降脂等途徑拮抗高血糖所導(dǎo)致的代謝紊亂，起到腎臟保護作用[9]。槐花出自《日華子本草》，為豆科植物槐(SophoraJaponicaL.)的干燥花蕾及花[10]，其味苦，性微寒，能清肝瀉火，涼血止血。山奈酚、蘆丁、異鼠李素、槲皮素等是槐花的主要有效成分[11]。研究表明，山奈酚具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)改善肥胖、抗凝血、抗癌等功效[12-14]。蘆丁具有抗病毒、抗氧化和抗炎等作用[15-16]。異鼠李素不僅有抗炎作用[17]，還可以通過抑制生長轉(zhuǎn)化因子(transforming growth factor，TGF)-β信號通路改善肝纖維化和降低氧化應(yīng)激水平[18]。在“黃芩-槐花”藥對配伍應(yīng)用中，槐花以涼血為主，黃芩以瀉火為要，二者配伍，可使苦寒瀉熱、涼血降壓的力量增強，臨床上適用于肝火亢盛的高血壓患者。本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)揭示“黃芩-槐花”藥對治療高血壓的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 數(shù)據(jù)來源于中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)；治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org/)；CTD數(shù)據(jù)庫(http：//ctdbase.org/)；Genecards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)；VENNY2.1(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html )在線工具；Metescape(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；RSCB PBD數(shù)據(jù)庫 (http：//www.rcsb.org/) ；Sybyl 7.3 軟件；Cytoscape3.6.0軟件。

1.2方法

1.2.1“黃芩-槐花”候選化合物篩選與作用靶點分析 在TCMSP中檢索“黃芩”“槐花”的化學成分，進行口服生物利用度(oral bioavailability，OB) 和類藥性(drug likeness，DL) 分析( TCMSP 網(wǎng)站標準：OB≥30%且DL≥0.18) 收集篩選“黃芩”“槐花”候選化合物，并檢索及其相關(guān)靶點，在UniProt數(shù)據(jù)庫中得到對應(yīng)的官方名稱，使用Cytoscape軟件建立藥物的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)模型[19-20]。

1.2.2高血壓相關(guān)靶點預(yù)測 從TTD、OMIM、CTD和Genecards數(shù)據(jù)庫檢索高血壓疾病靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫得到對應(yīng)的官方名稱。利用VENNY2.1在線工具將“黃芩-槐花”和高血壓矯正后的靶點基因取交集。

1.2.3“黃芩-槐花”治療高血壓的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 查找交集靶點基因在“黃芩-槐花”中對應(yīng)的候選化合物，使用Cytoscape軟件構(gòu)建藥對治療高血壓的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)模型，并通過Network analyze插件篩選節(jié)點較多的關(guān)鍵化合物和作用靶點。

1.2.4作用靶點蛋白功能歸屬和通路注釋分析 利用Metescape平臺對交集基因進行作用靶點蛋白功能歸屬，探討“黃芩-槐花”參與調(diào)節(jié)高血壓的物質(zhì)類型。同時在平臺上將輸入物種和分析物種均設(shè)置為“H.sapiens”，設(shè)置P<0.01，對作用靶點進行GO注釋分析及KEGG通路分析。

1.2.5分子對接 選取“黃芩-槐花”治療高血壓的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)中度值≥5的化合物，與高血壓相關(guān)靶點進行分子對接?；衔镉肧ybyl 7.3[21]中sketch模塊構(gòu)建，添加Gasterger-Huckel 電荷，加氫后用Tripos力場優(yōu)化，得到最低能量構(gòu)象，收斂標準為0.004 kJ/( mol·A)。從PDB庫中下載高血壓靶點蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，登錄號：3NOS，1UZF。采用Sybyl 7.3中的Surflex-Dock程序進行分子對接。本研究中選取與原配體對比后，結(jié)合作用較好的有代表性的化合物進行分析。

1.2.6動物實驗 異鼠李素(isorhamnetin，ISO)和蘇薺黃酮(moslosooflavone，MOS)均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；卡托普利(captopril，CAP)購于廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號：H44021595。16周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hyertensive rat，SHR)24只和雄性無特定病原體(SPF)級京都種大鼠(wistar-kyoto rat，WKY)6只，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006，實驗動物合格證號：20160167。采用隨機數(shù)字分法，將SHR大鼠分為4組，包括高血壓模型組(SHR)、異鼠李素組(ISO組，150 mg·kg-1·d-1)、蘇薺黃酮組(MOS組，150 mg·kg-1·d-1)及卡托普利組(CAP組，13.5 mg·kg-1·d-1)，另設(shè)正常血壓對照組(WKY組)，連續(xù)給藥6周。

1.2.7大鼠血壓檢測 使用無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)儀(型號：ALC-NIBP)，每周檢測各組大鼠尾動脈收縮壓和舒張壓，取其連續(xù)3次平均值作為其平均血壓值。

1.2.8大鼠血清中血管內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的檢測 各組大鼠給藥6周后，尾靜脈取血，收集血清，用大鼠eNOS 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司，批號：CSB-E08323r)檢測eNOS；ACE的ELISA試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司，批號：CSB-E04490r)檢測ACE。

1.2.9蛋白免疫印跡法檢測大鼠內(nèi)皮中eNOS蛋白水平的表達 用組織勻漿機和超聲破碎儀將血管內(nèi)皮組織研磨至均質(zhì)液體，4 ℃，12 000×g離心30 min，取上清液，并用BCA 試劑盒測定蛋白含量。每孔上樣量為40 μg，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)2 h至孔徑0.45 μm聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，eNOS(武漢博士德公司，批號：EK0697)一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST 洗膜4 次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜4 次后，F(xiàn)luorChem R 多功能成像分析系統(tǒng)進行顯影，用Image J 軟件進行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1“黃芩-槐花”藥對的活性成分 通過OB≥30，DL≥0.18的標準篩選后，“黃芩-槐花”中有41個化合物具有較好的OB和DL，將其作為候選化合物，結(jié)果見表1。在黃芩活性成分中，OB最高為黃芩新素(neobaicalein，OB=104.34%)，DL最高為黃連堿(coptisine，DL=0.86)，大多數(shù)黃酮類化合物均有較高OB值和DL值，如降穿心蓮黃酮(panicolin，OB=76.26%，DL=0.29)，黃芩總黃酮Ⅱ(skullcapflavoneⅡ，OB=69.51%，DL=0.44)，蘇薺黃酮(moslosooflavone，OB=44.09%，DL=0.25)等，目前廣泛應(yīng)用于臨床，可用于治療心血管及代謝性疾病。符合篩選條件的槐花化合物中，OB最高為異鼠李素(isorhamnetin，OB=49.6，DL=0.31)，DL較高為N-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide(DL=0.78)此外，山奈酚(kaempferol)具有抗腫瘤、抗炎作用[22]，能改善小鼠模型心功能障礙和心肌纖維化[23]。

2.2“候選活性化合物-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)模型 41個候選活性化合物與作用靶點的網(wǎng)絡(luò)模型，見圖1。因4個化合物在數(shù)據(jù)庫中尚無作用靶點(表1)，故構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型中包含264個節(jié)點(37個化合物和227個潛在靶點)和766條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，紅色節(jié)點代表分子，藍色節(jié)點代表靶點，節(jié)點大小代表度值(degree)的大小，每個節(jié)點的度值表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連的邊的條數(shù)。如每一個紅點的度值代表候選化合物所擁有的靶點數(shù)目；而每一個藍點的度值則代表著相應(yīng)靶點所對應(yīng)的相關(guān)化合物數(shù)目。圖1中，分子0098(槲皮素，quercetin)的作用靶點最多(degree=154)，接著是0422(山奈酚，kaempferol)(degree=63)，0173(漢黃芩素，wogonin)(degree=44)等，這些化合物具有較多的作用靶點，可能在該藥對的藥理功能中起到較為核心的作用。在作用靶點方面，前列腺素G /H 合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2，degree=31)，前列腺素G /H 合成酶1(prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1，degree=28)，熱休克蛋白(heat shock protein HSP 90，HSP90，degree=28)，有較多的化合物配體。在227個潛在靶點中，至少有111個靶點與2個或以上的化合物相連，根據(jù)表1的度值，在網(wǎng)絡(luò)模型中，至少有33個化合物都與≥3個作用靶點相連接，說明“黃芩-槐花”具有多成分、多靶點的復(fù)雜性。

圖1 候選化合物與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表1 通過OB和DL預(yù)測的41個候選化合物

2.3“黃芩-槐花”作用靶點蛋白的功能歸屬及化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 從4個數(shù)據(jù)庫中收集高血壓相關(guān)基因與“黃芩-槐花”的作用靶點取交集后共得到45個靶點，包括一氧化氮合酶3、血栓調(diào)節(jié)蛋白、腎上腺素受體β2等。表2為Metascape數(shù)據(jù)庫中45個靶點對應(yīng)的蛋白功能，表明轉(zhuǎn)錄因子、受體、酶、離子通道等物質(zhì)參與“黃芩-槐花”治療高血壓的過程。交集靶點對應(yīng)的化合物信息見表3，其度值(degree)代表化合物所對應(yīng)的高血壓靶點的數(shù)目?！包S芩-槐花”治療高血壓的相關(guān)化合物及靶點網(wǎng)絡(luò)模型見圖2，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型中包含71個節(jié)點(26個化合物和45個潛在靶點)和142條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，紅色菱形節(jié)點代表靶點，綠色三角形節(jié)點代表化合物。

圖2 “黃芩-槐花”治療高血壓的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 45個高血壓靶點的蛋白功能

續(xù)表2 45個高血壓靶點的蛋白功能

表3 45個高血壓靶點對應(yīng)的26個化合物

2.4基因功能和通路富集分析 GO注釋分析可描述基因生物學功能，由分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP) 和細胞組成(cellular component，CC) 三個部分組成。其中，分子功能分析(圖3A) 主要是蛋白磷酸酶結(jié)合、腎上腺素能受體活性、蛋白質(zhì)異源二聚反應(yīng)活性、細胞因子受體結(jié)合等幾個靠前；生物過程(圖3B) 中排名靠前的有：循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、活性氧代謝過程、細胞因子介導(dǎo)的信號通路、細胞對有機含氮化合物的反應(yīng)等；而在細胞組成 (圖3C) 分析中靠前的主要是細胞膜、細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外側(cè)、軸突、肌膜等。

KEGG pathway 富集分析發(fā)現(xiàn)45個靶點涉及17條通路(圖3D)，包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號通路、鈣信號通路、Apelin信號通路、肥厚型心肌病等。

A.分子功能；B.生物過程；C.細胞組成；D.KEGG通路。

2.5分子對接 結(jié)果表明異鼠李素作用于eNOS靶點；蘇薺黃酮作用于ACE靶點；分子間的相互作用見圖4，綠色條帶為蛋白質(zhì)，黃色虛線為氫鍵作用。其中異鼠李素與eNOS原配體的結(jié)合方式最相似，一方面與活性口袋中的ARG365以及ALA446形成氫鍵，另一方面，與eNOS形成π-π堆積作用，表明異鼠李素與eNOS的結(jié)合作用較好。 蘇薺黃酮與ACE的活性口袋中的HIS513、TYR520、GLN281均形成氫鍵，和卡托普利結(jié)合ACE的方式相似。

2.6體內(nèi)實驗 結(jié)果見圖5。與正常對照組比較，SHR組大鼠收縮壓和舒張壓均顯著升高 (P<0.01)，而ISO和MOS治療后均能降低大鼠的收縮壓和舒張壓 (P<0.01)，提示ISO和MOS均有一定的降壓作用。

A.異鼠李素的化學結(jié)構(gòu)；B.蘇薺黃酮的化學結(jié)構(gòu)；C.異鼠李素與eNOS的結(jié)合位點；D.蘇薺黃酮與ACE 的結(jié)合位點。

ELISA結(jié)果顯示，SHR組大鼠血清及內(nèi)皮中的eNOS水平顯著低于WKY組，而ACE水平高于WKY組(圖5C-5F)，治療后發(fā)現(xiàn)，ISO能有效升高eNOS的水平(P<0.01)，MOS則明顯降低ACE的水平(P<0.01)。

3 討論

中藥治療原發(fā)性高血壓具有一定優(yōu)勢，在一定程度上能起到補充治療的作用[24]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學首次構(gòu)建 “黃芩-槐花”藥對治療高血壓的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)包含71個節(jié)點，142條邊，體現(xiàn)成分和靶點之間的復(fù)雜作用。

GO分析發(fā)現(xiàn)黃芩、槐花治療高血壓主要生物過程涉及循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、活性氧代謝過程、細胞因子介導(dǎo)的信號通路等方面。分子功能涉及蛋白磷酸酶結(jié)合、腎上腺素能受體活性、蛋白質(zhì)異源二聚反應(yīng)活性、細胞因子受體結(jié)合等方面。細胞組成涉及細胞膜、細胞外基質(zhì)、軸突、肌膜等方面。

KEGG通路富集結(jié)果表明，藥對治療高血壓的作用機制與包括HIF-1信號通路、鈣信號通路、Apelin信號通路在內(nèi)的17條信號通路相關(guān)，與現(xiàn)有研究結(jié)果報道一致：HIF-1的持續(xù)升高會損傷血管內(nèi)皮，引起血管生成障礙及影響血管壁完整性，導(dǎo)致血壓升高；作為第二信使的細胞內(nèi)鈣離子，能調(diào)控細胞的生存和凋亡，同時調(diào)節(jié)機體的生理病理過程。鈣離子拮抗劑(calcium channel blockers，CCB)也是臨床常用的降壓藥物，CCB可通過阻斷L型鈣通道降低血管阻力，減少血壓的變異性[25]；Apelin可刺激一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成，從而舒張血管，降低血壓。上述結(jié)果提示，“黃芩-槐花”藥對通過多途徑在高血壓病理發(fā)展過程中起調(diào)節(jié)作用。

①與WKY組比較，P<0.01；②與SHR組比較，P<0.01；③與SHR組比較，P<0.05。

進一步對17條信號通路分析后，筆者選取與多條通路有相互作用的重要基因—人血管內(nèi)皮型一氧化氮合酶(PDB ID：3NOS)作為分子對接的靶點蛋白，以晶體結(jié)構(gòu)中自帶配體為陽性對照，進行分子對接實驗。同時選取臨床一線降壓藥物血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的作用靶點，即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(PDB ID：1UZF)作為分子對接的第二個候選靶點，分析篩選藥對中作用于這兩個靶點的活性成分。結(jié)果表明，槐花中的異鼠李素與eNOS靶點作用力強，黃芩中蘇薺黃酮與ACE靶點結(jié)合性好，提示二者可能起協(xié)同作用。它們可通過氫鍵、π-π堆積、疏水作用等與靶點蛋白結(jié)合，在一定程度上揭示了藥對的分子作用機制。

動物體內(nèi)實驗驗證表明，異鼠李素和蘇薺黃酮均能降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，且異鼠李素可增加大鼠血清及內(nèi)皮中的eNOS表達，蘇薺黃酮可降低血清ACE水平，與分子對接靶點預(yù)測結(jié)果相符。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法、分子對接、信號通路富集等多種方法對“黃芩-槐花”藥對的化學成分、作用靶點和治療高血壓的作用機制進行探索性研究，并利用動物體內(nèi)實驗進行初步驗證。本研究符合轉(zhuǎn)化醫(yī)學的宗旨，從臨床工作中發(fā)現(xiàn)并提出問題，旨在闡明“黃芩-槐花”藥對治療高血壓的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制，為其臨床應(yīng)用提供科學的實驗依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

此外，異鼠李素和蘇薺黃酮只是“黃芩-槐花”中眾多成分之一，其體內(nèi)實驗結(jié)果表明二者能明顯作用于降壓靶點，首次在一定程度上說明其均為“黃芩-槐花”藥對中的物質(zhì)基礎(chǔ)，但由于中藥成分復(fù)雜，仍需要對“黃芩-槐花”多種單體進行藥效學研究及機制探索。同時，本實驗未考慮藥物在煎煮過程中可能發(fā)生的化學反應(yīng)及藥物成分的變化，將在下一步實驗中進行中藥血清藥物化學的研究，以期解決藥物成分變化的問題，為“黃芩-槐花”的臨床應(yīng)用及安全性分析提供數(shù)據(jù)參考。