馬澤南，顧利華

（蘇州市吳中人民醫(yī)院1.兒科2.麻醉科，江蘇 蘇州 215000）

哮喘是兒科的常見病。近年來，臨床上普遍認(rèn)為小兒哮喘是一種多基因遺傳疾病。近年來，小兒哮喘的發(fā)病率越來越高[1]。有研究資料顯示，小兒哮喘的發(fā)生與白細(xì)胞介素-4（IL-4）基因及白細(xì)胞介素-13（IL-13）基因的多態(tài)性有關(guān)。在本次研究中，筆者主要探究IL-4基因及IL-13基因的多態(tài)性與小兒哮喘發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對(duì)象是2016年1月至2019年2月期間蘇州市吳中人民醫(yī)院收治的35例哮喘患兒和在該院進(jìn)行體檢的35例健康兒童。本次研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)為：1)其家長對(duì)本次研究知情同意。2）其病情符合《兒童支氣管哮喘診斷與預(yù)防指南》(2008修訂版)中關(guān)于哮喘的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。其排除標(biāo)準(zhǔn)為：1）由其他疾?。毙院硌住缀?、喉氣管支氣管炎、先天性氣道畸形等）引起的哮喘。2)參加本次研究前使用過糖皮質(zhì)激素或免疫調(diào)節(jié)劑。3)合并有原發(fā)性免疫功能障礙。4)合并有心肺衰竭。5)有濕疹、鼻炎及哮喘的病史。將35例健康兒童設(shè)為對(duì)照組。將35例哮喘患兒設(shè)為哮喘組。兩組研究對(duì)象的一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。本研究經(jīng)過蘇州市吳中人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

采用PCR法對(duì)兩組研究對(duì)象的血漿進(jìn)行核苷酸多態(tài)性檢測，方法為：在清晨，取研究對(duì)象的空腹靜脈血2 mL，將靜脈血放入裝有乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)的試管中作為樣品，在-70℃下保存樣品。用DNA提取試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。采用擴(kuò)增 酶（Premix primer STAR，NEB）對(duì) 提 取 的DNA進(jìn)行IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590的C/T位點(diǎn)及IL-13基因變異體Arg130Gln的G/A位點(diǎn)擴(kuò)增。為IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590的C/T位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物的方法為:擴(kuò)增上游引物的順序?yàn)?-GGATGTGTTTAGGTTCCATTCA-3；擴(kuò)增下游引物的順序?yàn)?-CCTCCTGGGGAAAGATAGAGTAA-3。為IL-13基 因 的 變 異 體Arg130Gln的G/A位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物的方法為：擴(kuò)增上游引物的順序?yàn)?-AAGGAATTTTACCCCTCCCTAAC-3；擴(kuò)增下游引物的順序?yàn)?-GAATGAGACAGTCCCTGGAAAG-3。PCR條件為：1）預(yù)變性：98℃，4 min；變性：94℃，45 s；退火：68℃，45 s；延伸：72℃，1 min。共循環(huán)20回。2）變性：94℃，45 s；退火：58℃，45 s；延伸：72℃，1 min；修復(fù)延伸：720℃，6 min。共循環(huán)20回。然后，將反應(yīng)后的產(chǎn)物放入濃度為2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并加入5 μL的擴(kuò)增液及適量的溴酚藍(lán)。將電壓設(shè)置為100 V，將電泳的時(shí)間設(shè)置為30 min。然后，取下凝膠，在紫外線下觀察結(jié)果。對(duì)反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，用基因測序儀對(duì)經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590C/T位點(diǎn)的基因頻率

對(duì)兩組患者IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590的C/T位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增后可得到三種類型的基因，分別是CC型基因、CT型基因及TT型基因。與對(duì)照組研究對(duì)象相比，哮喘組研究對(duì)象IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590 C/T位點(diǎn)的CC型基因頻率、CT型基因頻率及C位點(diǎn)基因頻率均較低，其IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590 C/T位點(diǎn)的TT型基因及T位點(diǎn)基因頻率均較高，P＜0.05。詳見表1。

2.2 兩組研究對(duì)象IL-13基因變異體Arg130GlnG/A位點(diǎn)的基因頻率

對(duì)兩組患者IL-13基因變異體Arg130Gln的G/A位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增后可得到三種類型的基因，分別是GG型基因、GA型基因及AA型基因。與對(duì)照組研究對(duì)象相比，哮喘組研究對(duì)象IL-13基因變異體Arg130Gln G/A位點(diǎn)的GG型基因頻率、GA型基因頻率及G位點(diǎn)基因頻率均較低，其IL-13基因變異體Arg130Gln G/A位點(diǎn)的AA型基因頻率及A位點(diǎn)基因頻率均較高，P＜0.05。詳見表2。

表1 兩組研究對(duì)象IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590 C/T位點(diǎn)的基因頻率（%）

表2 兩組研究對(duì)象IL-13基因變異體Arg130Gln G/A位點(diǎn)的基因頻率(%)

3 討論

目前，臨床上普遍認(rèn)為小兒哮喘是一種多基因遺傳病。此病的遺傳率可高達(dá)60%～80%[2]。小兒哮喘主要是由于患兒的氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)所致。與炎癥反應(yīng)有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子有免疫球蛋白E（IgE）、IL-4、IL-13等。有研究資料顯示，IL-4基因與IL-13基因間的交互作用是導(dǎo)致小兒哮喘發(fā)生的主要因素[3]。IL-4基因可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管細(xì)胞黏附分子的表達(dá)及T細(xì)胞的轉(zhuǎn)型，進(jìn)而可導(dǎo)致哮喘的發(fā)生[4-5]。有研究資料顯示，IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590的C/T位點(diǎn)及IL-13基因變異體Arg130Gln的G/A位點(diǎn)發(fā)生突變與哮喘的發(fā)生具有相關(guān)性。擁有T等位基因或A等位基因的兒童更易發(fā)生哮喘[6-7]。本次研究的結(jié)果顯示，與對(duì)照組研究對(duì)象相比，哮喘組研究對(duì)象IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590 C/T位點(diǎn)的CC型基因頻率、CT型基因頻率及C位點(diǎn)基因頻率均較低，其IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590 C/T位點(diǎn)的TT型基及T位點(diǎn)基因頻率均較高，P＜0.05。與對(duì)照組研究對(duì)象相比，哮喘組研究對(duì)象IL-13基因變異體Arg130Gln G/A位點(diǎn)的GG型基因頻率、GA型基因頻率及G位點(diǎn)基因頻率均較低，其IL-13基因變異體Arg130Gln G/A位點(diǎn)的AA型基因頻率及A位點(diǎn)基因頻率均較高，P＜0.05。從本次研究的結(jié)果推論，IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590的C/T位點(diǎn)為TT型基因的患兒發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)較該位點(diǎn)為CC型基因的患兒更高。IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)-590的C/T位點(diǎn)為T等位基因的患兒發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)較該位點(diǎn)為C等位基因的患兒更高。IL-13基因變異體Arg130Gln的G/A位點(diǎn)為AA型基因的患兒發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)較該位點(diǎn)為GG型基因的患兒更高。IL-13基因變異體Arg130Gln的G/A位點(diǎn)為A等位基因的患兒發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)較該位點(diǎn)為G等位基因的患兒更高。

綜上所述，IL-4基因及IL-13基因的多態(tài)性與小兒哮喘的發(fā)生存在相關(guān)性。