劉 婷，熊軼喆，杜國慶，王 翔

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院骨傷科，上海 200021)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是以局部關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵、畸形為主要臨床表現(xiàn)的慢性關(guān)節(jié)軟骨退行性病變，可導(dǎo)致患者活動能力受限，是中老年人的常見病、多發(fā)病。研究表明，盤龍七片治療寒濕痹阻型膝骨關(guān)節(jié)炎疾病臨床效果顯著，能夠緩解患者疼痛腫脹的癥狀，安全性較高，具有很高的臨床應(yīng)用價值。然而盤龍七片治療OA的具體作用機制尚不清楚。研究表明，軟骨細(xì)胞過度凋亡是骨性關(guān)節(jié)炎的主要病理特征，在動物和人的體內(nèi)、體外研究中軟骨細(xì)胞凋亡與OA嚴(yán)重程度之間有相關(guān)性。沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1(silent information regulator type 1，SIRT1)廣泛存在于機體多種細(xì)胞之中，參與多種疾病的病理過程，在OA的抗炎中起著重要作用。劉軍等研究表明，薯蕷皂苷元通過激活SIRT1通路，進(jìn)一步減輕軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)、線粒體氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮預(yù)防與治療OA的作用。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路在各種細(xì)胞進(jìn)程中起著重要作用，不僅可以調(diào)節(jié)炎癥作用，還可以調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。魯宏等研究表明，香葉木素通過抑制NF-κB通路活化緩解白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的新生大鼠OA軟骨細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步研究其作用機制，本研究從細(xì)胞凋亡和SIRT1/NF-κB信號通路的角度探究盤龍七片治療OA的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級C57B/L6雄性小鼠60只(4～6周齡)，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2019-0047]。

1.2 藥物和試劑 盤龍七片(批號 20190401，每片0.3 g)：陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司；硫酸氨基葡萄糖膠囊(批號 2392016，每粒0.25 g)：浙江海正藥業(yè)股份有限公司；生理鹽水(國藥準(zhǔn)字 H13023201)：石家莊第四制藥廠；DMEM-F12培養(yǎng)基(11320-033)、胰蛋白酶(25200-056)：Thermo Fisher Scientific；胎牛血清(F8245-100)：杭州四季青有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗山羊抗鼠IgG(ZB-2305)：中杉金橋公司。蛋白提取裂解液(P0013)、BCA試劑盒(P0010)、Annexin Ⅴ-FITC試劑盒(C1063)：江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin單克隆抗體(9470)、NF-κB單克隆抗體(8242)：Cell Signaling Technology；SIRT1單克隆抗體(ab110304)：Abcam公司。Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin基因序列設(shè)計引物：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 動物分組及模型復(fù)制 參考文獻(xiàn)[7]的方法，手術(shù)切除小鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板和前交叉韌帶，以復(fù)制OA模型。模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠出現(xiàn)步態(tài)異常和行走緩慢，且小鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)直徑較右側(cè)增加值≥0.5 mm。模型復(fù)制成功后，將小鼠隨機分成模型組，盤龍七片低、中、高劑量組，陽性對照組，每組10只，并設(shè)置正常對照組。盤龍七片低、中、高劑量組小鼠分別按137、273、546 mg/(kg·d)給藥，陽性對照組小鼠按228 mg/(kg·d)給予硫酸氨基葡萄糖，去掉膠囊后溶于生理鹽水中灌胃。將盤龍七片研磨成粉末，用生理鹽水溶解后灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)4周。正常對照組、模型組小鼠給予等容積生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。4周后采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，無菌條件下剪取小鼠膝關(guān)節(jié)組織(股骨髁及脛骨平臺軟骨)，剝離軟骨組織，待用。

2.2 軟骨組織染色 將分離的軟骨組織用4%多聚甲醛溶液固定，然后使用番紅O-快速綠染色。參考改良的Mankin等評分方法，從整體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、番紅染色、潮線完整性4個方面對小鼠的OA進(jìn)行評分，最低0分，最高14分，評分越高，表明關(guān)節(jié)炎越嚴(yán)重。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞凋亡 無菌條件下分離小鼠軟骨組織，剪碎并加入胰蛋白酶消化后，離心，收集軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行后續(xù)實驗。使用DMEM培養(yǎng)液制備1×10/mL的單細(xì)胞懸液，使用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入Annexin Ⅴ-FITC試劑盒試劑，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2.4 qRT-PCR檢測軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 收集各組軟骨細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取各組軟骨細(xì)胞總RNA，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，將cDNA于-20 ℃冰箱保存。采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃，120 s；95 ℃，30 s；60 ℃，75 s；95 ℃，30 s；40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔC法計算Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。Bax、Bcl-2、Caspase-3及內(nèi)參β-actin基因引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.5 Western blot法檢測軟骨細(xì)胞SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)水平 收集各組軟骨細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑裂解液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取各組總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，100 ℃水浴變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% BSA室溫封閉2 h，分別加入1∶2 000稀釋的SIRT1、NF-κB抗體，4 ℃過夜孵育，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL顯色液，利用凝膠成像儀對Western blot印跡條帶進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)學(xué)變化 番紅O-快速綠染色結(jié)果顯示：正常對照組小鼠細(xì)胞核呈藍(lán)色，關(guān)節(jié)間隙正常，細(xì)胞排列層次分明，關(guān)節(jié)軟骨組織被染成紅色，軟骨下骨為綠色；模型組小鼠膝關(guān)節(jié)面不平整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次混亂，關(guān)節(jié)間隙十分狹窄；盤龍七片低、中、高劑量組小鼠關(guān)節(jié)間隙稍狹窄，但仍清晰可見，但有部分破壞，隨著濃度升高，關(guān)節(jié)間隙明顯，關(guān)節(jié)輪廓可見。見圖1。

注:A.正常對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.盤龍七片低劑量組;E.盤龍七片中劑量組;F.盤龍七片高劑量組圖1 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)學(xué)變化(番紅O-快速綠染色,10×20倍)

3.2 各組小鼠的OA評分比較 與模型組比較，陽性對照組和盤龍七片低、中、高劑量組小鼠的OA評分均顯著降低(

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05)，盤龍七片降低OA評分的效應(yīng)呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組小鼠的OA評分比較

3.3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率比較 與正常對照組比較，模型組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增加(

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05)；與模型組比較，陽性對照組和盤龍七片低、中、高劑量組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(

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05)；盤龍七片降低軟骨細(xì)胞凋亡率的效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性(

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05)。見圖2和表3。

注:A.正常對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.盤龍七片低劑量組;E.盤龍七片中劑量組;F.盤龍七片高劑量組圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率

表3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率比較

3.4 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著增加，Bcl-2表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

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05)；與模型組比較，陽性對照組和盤龍七片低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

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05)，盤龍七片的效應(yīng)呈劑量依賴性。見表4。

表4 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)水平比較

3.5 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT1、NF-κB蛋白相對表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠軟骨細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平顯著降低，NF-κB表達(dá)水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

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05)；與模型組比較，陽性對照組與盤龍七片低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平顯著增加(

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05)，NF-κB表達(dá)水平顯著降低(

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05)，盤龍七片的效應(yīng)呈劑量依賴性。見圖3和表5。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.盤龍七片低劑量組；E.盤龍七片中劑量組；F.盤龍七片高劑量組

表5 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT1、NF-κB蛋白相對表達(dá)水平比較

4 討論

OA是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)(單側(cè)或雙側(cè))疼痛、酸脹、關(guān)節(jié)僵硬，重者站立及行走等活動功能障礙，有著高發(fā)病率、高致殘率、治療周期長的特點。在本研究中，番紅O-快速綠染色顯示正常對照組細(xì)胞核呈藍(lán)色，關(guān)節(jié)間隙正常，細(xì)胞排列層次分明，關(guān)節(jié)軟骨組織被染成紅色，軟骨下骨為綠色，而模型組關(guān)節(jié)面不平整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次混亂，關(guān)節(jié)間隙十分狹窄，與譚清梅等研究結(jié)果類似，提示小鼠OA模型復(fù)制成功。

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“骨痹”范疇。中醫(yī)學(xué)治療寒濕痹阻型OA的方法較多，但治法幾乎以祛風(fēng)散寒除濕為主。盤龍七片主要包含盤龍七、川烏、草烏、當(dāng)歸、杜仲、丹參等29味藥材，盤龍七具有補脾健胃、收澀固腸、除濕利水、活血之功，丹參具有擴張血管，加強心肌收縮的功能，方中川烏、草烏、秦艽、伸筋草祛風(fēng)散寒除濕止痛。諸藥共奏活血化瘀、祛風(fēng)除濕、消腫止痛之功，常與其他藥物聯(lián)合治療OA。研究表明，盤龍七對寒濕痹阻型OA有效。小鼠寒濕痹阻型OA模型尚無文獻(xiàn)依據(jù)，因此，本研究復(fù)制小鼠OA模型時未考慮中醫(yī)證型。本研究發(fā)現(xiàn)，使用盤龍七片治療后，OA小鼠膝關(guān)節(jié)破壞減輕，關(guān)節(jié)間隙明顯，提示盤龍七片對OA具有一定的保護作用。

有研究表明，軟骨細(xì)胞凋亡以及軟骨下骨異常骨重建與OA發(fā)病密切相關(guān)。何健宜等研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的OA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨凋亡細(xì)胞數(shù)增多。因此，尋找有效抑制軟骨細(xì)胞過度凋亡且能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的藥物具有重要意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組軟骨細(xì)胞凋亡率增加，與模型組比較，盤龍七片低、中、高劑量組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低，并呈劑量依賴性，提示盤龍七片有抑制小鼠軟骨細(xì)胞凋亡的作用。Bax mRNA是促凋亡基因，Bcl-2 mRNA為抗凋亡基因，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，盤龍七片呈劑量依賴性地降低小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平，升高Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，提示盤龍七片抑制小鼠軟骨細(xì)胞凋亡的機制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平有關(guān)。

SIRT1廣泛存在于機體多種細(xì)胞之中，被認(rèn)為與細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、增殖凋亡等密切相關(guān)，在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成及抗炎作用中起著重要作用。李春亮等研究表明，SIRT1在OA軟骨組織中低水平表達(dá)，通過上調(diào)SIRT1表達(dá)水平，可顯著抑制軟骨細(xì)胞凋亡及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與OA的病理進(jìn)程，其中NF-κB通路通過促炎反應(yīng)發(fā)揮作用已被證實。研究表明，激活SIRT1可抑制NF-κB信號途徑的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Zhang等研究表明，小檗堿能夠通過調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB信號通路，抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Han等研究表明，SIRT1通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，而阻止人卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盤龍七片呈劑量依賴性地升高OA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平，降低NF-κB表達(dá)水平。結(jié)果提示盤龍七片可能通過上調(diào)SIRT1的表達(dá)水平，抑制NF-κB信號通路，進(jìn)一步抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，盤龍七片可抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與SIRT1/NF-κB信號通路有關(guān)。但本研究局限于SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平的變化情況，未對通路進(jìn)行驗證，仍需做進(jìn)一步研究。