劉巖路，胡 煒，艾克拜爾·艾拜也都拉，伊力亞·依力哈木，黃異飛

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脊柱二科，烏魯木齊 830000

下腰痛主要表現(xiàn)為肋緣和臀下皺襞之間的疼痛、僵硬及肌肉緊張，發(fā)生率高，已成為全球性的醫(yī)療保健問(wèn)題［1-2］。在臨床上，下腰痛可能是多種疾病的癥狀，而椎間盤退行性變是導(dǎo)致下腰痛發(fā)生的主要因素［3］。椎間盤內(nèi)無(wú)血管走行，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和物質(zhì)代謝主要靠終板來(lái)完成［4］。當(dāng)軟骨終板發(fā)生損傷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致椎間盤纖維化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞外基質(zhì)減少，致使損傷終板所在椎間盤發(fā)生漸進(jìn)性結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致椎間盤形態(tài)、穩(wěn)定性和功能的缺失，從而引起下腰痛［5-7］。

半乳糖凝集素3是一種分子量為29 000 ~ 35 000的蛋白質(zhì)，屬于β-半乳糖苷結(jié)合動(dòng)物凝集素家族，在多種組織中均有表達(dá)［8］。近年研究［9］發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素3可作為軟骨細(xì)胞的標(biāo)志物和促生因子，促進(jìn)軟骨細(xì)胞存活和軟骨基質(zhì)礦化。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素3可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子和趨化因子的表達(dá)在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中發(fā)揮作用［10］。本研究旨在探討半乳糖凝集素3對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、趨化因子（C-C基元）配體3（CCL3）及聚蛋白多糖的影響，為闡明椎間盤退行性變的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠軟骨終板細(xì)胞和大鼠軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。MTT試劑盒購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；TIANScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；CCL3兔抗多克隆抗體（A7568）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；MMP-3抗體（EP1186Y）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；聚蛋白多糖多克隆抗體購(gòu)自北京安諾倫生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞傳代及分組

參考文獻(xiàn)［11］的操作方法，將大鼠軟骨終板細(xì)胞（1周內(nèi)提?。囊旱腥〕?，快速放入37℃水浴鍋中，輕搖凍存管使凍存液溶解；溶解后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細(xì)胞（1 000 r/min，離心10 min，離心半徑為13.5 cm），用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞；將細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。間隔2 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞融合約80%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集細(xì)胞，按1∶3傳代，將P2代大鼠軟骨終板細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，同時(shí)設(shè)空白孔，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞分為2組，一組加入含25 μmol/L GB1107半乳糖凝集素3抑制劑（抑制劑組），另一組加入等體積空白溶劑（對(duì)照組）。

1.3 細(xì)胞存活率分析

分組處理完成后12 h、24 h、48 h各取1塊96孔板，每孔加入10 μL MTT，37℃培養(yǎng)4 h；吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO震蕩10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔568 nm處光密度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。以上操作重復(fù)3次。

1.4 MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖mRNA的表達(dá)

分組處理完成后24 h收集細(xì)胞，提取總RNA，使用TIANScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。內(nèi)參GAPDH正向引物為5"-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3"，反向引物為5"-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3"；MMP-3正向引物為5"-GAATCCCCTGATGTCCTCGT-3"，反向引物為5"-TTTTCGCCAAAAGTGCCTGT-3"；CCL3正向 引物為5"-GCATTTAGTTCCAGCTCAGTGA-3"，反向引物為5"-GGACGGCAAATTCCACGAAA-3"；聚蛋白多糖正向引物為5"-TGGACTTGTCTCAGGTTTC-3"，反向引物為5"-AGTTGG GGCAGTTATGGAT-3"。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，2×SYBR Green預(yù)混液10 μL，去RNA酶水6.4 μL，cDNA模板2 μL，配制成20 μL體系，混合均勻。反應(yīng)條件：95℃ 60 s；95℃ 10 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；94℃ 90 s，60℃ 60 s。從60℃按1.1℃/s升溫至94℃，獲得實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果，采用2-ΔΔCt法量化目的基因表達(dá)水平。以上操作重復(fù)3次。

1.5 MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖蛋白的表達(dá)

分組處理完成后24 h收集細(xì)胞，用PBS洗凈細(xì)胞，加入120 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，在4℃下14 000×g（g=9.806 65 m·s-2）離心5 min（離心半徑13.5 cm）。取上清液適當(dāng)稀釋后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度。取50 μg變性蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE充分分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜放入5% BSA封閉液中，置于室溫下?lián)u床孵育1 h，加5 mL一抗稀釋液（工作濃度均為1∶1 000）于4℃冰箱過(guò)夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min，然后加10 mL二抗稀釋液（工作濃度為1∶50 000）置于搖床孵育2 h，顯色，在暗室中壓片曝光顯影。用Quantity-one圖像軟件分析并進(jìn)行光密度值掃描，計(jì)算目的蛋白條帶與GAPDH強(qiáng)度比值。以上操作重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 半乳糖凝集素3抑制劑對(duì)大鼠軟骨終板細(xì)胞增殖活性的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制劑組大鼠軟骨終板細(xì)胞處理12 h后活性開始逐漸降低，24 h、48 h細(xì)胞活性分別為69%和54%。抑制劑組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 2組大鼠軟骨終板細(xì)胞活性變化Fig. 1 Changes of activity of rat cartilage endplate cells in 2 groups

2.2 半乳糖凝集素3抑制劑對(duì)大鼠軟骨終板細(xì)胞MMP-3、CCL3、聚蛋白多糖表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制劑組大鼠軟骨終板細(xì)胞中MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制劑組大鼠軟骨終板細(xì)胞中MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖2 2組大鼠軟骨終板細(xì)胞MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的mRNA表達(dá)Fig. 2 Expressions of MMP-3，CCL3 and aggrecan mRNA of rat cartilage endplate cells in 2 groupsa：MMP-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量 b：CCL3的mRNA相對(duì)表達(dá)量 c：聚蛋白多糖的mRNA相對(duì)表達(dá)量a：Relative expression of MMP-3 mRNA b：Relative expression of CCL3 mRNA c：Relative expression of aggrecan mRNA

圖3 2組大鼠軟骨終板細(xì)胞MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的蛋白表達(dá)Fig. 3 Expressions of MMP-3，CCL3 and aggrecan protein of rat cartilage endplate cells in 2 groupsa：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) b：MMP-3的蛋白相對(duì)表達(dá)量 c：CCL3的蛋白相對(duì)表達(dá)量 d：聚蛋白多糖的蛋白相對(duì)表達(dá)量a：Western blotting b：Relative expression of MMP-3 protein c：Relative expression of CCL3 protein d：Relative expression of aggrecan protein

3 討 論

椎間盤退行性變是引起下腰痛的主要因素之一，其致病因素主要包括應(yīng)力損傷、炎性反應(yīng)、衰老、菌類感染、營(yíng)養(yǎng)障礙、遺傳和腫瘤等［12-14］。終板是椎間盤的重要組成部分，在維持椎骨正常形態(tài)、保護(hù)椎骨承受壓力及吸收靜態(tài)壓力等方面起著積極作用，同時(shí)終板是椎體中滲透轉(zhuǎn)運(yùn)能力的主要承擔(dān)者，是椎體的主要營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)通路［15］。終板的退行性變與椎間盤退行性變的產(chǎn)生有著密切聯(lián)系，但其確切機(jī)制仍不十分清楚。

有研究［16］表明，當(dāng)軟骨終板發(fā)生損傷時(shí)，促炎細(xì)胞因子水平升高，基質(zhì)降解酶活性增加，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖活性降低，使細(xì)胞外基質(zhì)大量降解，誘導(dǎo)軟骨終板破壞，促進(jìn)軟骨終板發(fā)生退行性變，最終導(dǎo)致椎間盤穩(wěn)態(tài)降低、結(jié)構(gòu)破壞等一系列病理改變。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠軟骨終板細(xì)胞增殖活性顯著降低，加劇細(xì)胞退行性變的發(fā)生，表明半乳糖凝集素3可以調(diào)控軟骨細(xì)胞活性，進(jìn)而可能對(duì)軟骨結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定造成影響，參與椎間盤退行性變的發(fā)生。

聚蛋白多糖一般以聚合體的形式在軟骨終板細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)發(fā)揮聚合作用，起到支撐細(xì)胞合成代謝的功能［17］。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，聚蛋白多糖表達(dá)量降低，導(dǎo)致細(xì)胞支撐力下降，促使細(xì)胞凋亡，表明半乳糖凝集素3可以調(diào)控聚蛋白多糖表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)影響軟骨細(xì)胞的合成代謝，參與椎間盤退行性變的發(fā)生。

MMP-3是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的主要成員，有研究［18-19］證明，MMP-3過(guò)表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)降解，最終導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退行性變。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠軟骨終板細(xì)胞MMP-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，提示半乳糖凝集素3可能通過(guò)調(diào)控軟骨終板細(xì)胞外基質(zhì)降解在椎間盤退行性變中發(fā)揮作用。

CCL3又被稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白，具有募集巨噬細(xì)胞的功能，在炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［20］，而巨噬細(xì)胞的數(shù)量與椎間盤退行性變程度呈正相關(guān)［3］。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠軟骨終板細(xì)胞CCL3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，表明半乳糖凝集素3可影響CCL3的表達(dá)，可能在椎間盤軟骨終板炎性細(xì)胞浸潤(rùn)中發(fā)揮作用，影響椎間盤退行性變的發(fā)生。

綜上所述，在軟骨終板細(xì)胞中抑制半乳糖凝集素3表達(dá)會(huì)降低軟骨終板細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞中MMP-3、CCL3和聚蛋白多糖的表達(dá)水平。MMP-3、CCL3的表達(dá)水平降低對(duì)軟骨終板細(xì)胞起到保護(hù)作用，而聚蛋白多糖表達(dá)和軟骨終板細(xì)胞增殖活性的降低起到促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞凋亡作用。查閱文獻(xiàn)［21］發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素3有2個(gè)具有爭(zhēng)議的作用，即促進(jìn)凋亡和抑制凋亡。Heidi等［22］的研究表明，半乳糖凝集素3在細(xì)胞內(nèi)抑制關(guān)節(jié)和肥大軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。但針對(duì)某些細(xì)胞類型，半乳糖凝集素3也具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用［23-25］。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)椎間盤退行性變的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究表明，抑制半乳糖凝集素3表達(dá)可抑制軟骨終板細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨終板發(fā)生退行性變。其可能是通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)降解、椎間盤炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞內(nèi)合成代謝的多重相互作用，來(lái)發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖活性的功能。本研究全新闡述了軟骨終板退行性變的可能作用機(jī)制，也為椎間盤退行性變的預(yù)防和治療提供了新的靶點(diǎn)。