盛秀云，張磊，王艷軍

聊城市第二人民醫(yī)院，山東聊城 252600

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）為彌漫性增生的 大B細(xì)胞惡性腫瘤，是一種最常見的非霍奇金淋巴瘤，在我國，DLBCL約占非霍奇金淋巴瘤的50%［1］。雖然40%的DLBCL患者經(jīng)過R-CHOP方案的治療后能夠達(dá)到持續(xù)緩解，但治療過程中仍然會(huì)有35%～45%的DLBCL患者治療無效或者效果不理想，DLBCL總體治療效果仍不能令人滿意［2-4］。隨著分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，越來越多的研究集中于尋找潛在的惡性腫瘤分子靶點(diǎn)來用于新的腫瘤治療，但至今尚未發(fā)現(xiàn)在DLBCL治療中療效顯著的靶向治療關(guān)鍵基因靶點(diǎn)。近年來，有關(guān)DLBCL的一些分子發(fā)病機(jī)制已被初步發(fā)現(xiàn)［5］。除了編碼基因外，還有一些非編碼基因，特別是微小RNA（miRNA），被廣泛認(rèn)為是調(diào)控DLBCL發(fā)生發(fā)展最重要的靶點(diǎn)之一［6］。mi R-195屬于miR-15、16/195家族重要成員之一，定位17p13.1，在肺癌［7］、結(jié)腸癌［8］、食管癌［9］、前列腺癌［10］等許多惡性腫瘤中表達(dá)異常，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-195在DLBCL患者腫瘤組織中表達(dá)明顯降低，并且與患者預(yù)后相關(guān)［11］，但mi R-195在DLBCL中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在檢測miR-195在DLBCL細(xì)胞中的表達(dá)及其過表達(dá)對(duì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等腫瘤生物學(xué)特性的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（日本TaKaRa公司）；CCK-8檢測試劑盒、RIPA裂解緩沖液（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）；miR-195 mimics、NC-mimics（上海吉瑪制藥公司）；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；Matrigel膠（美國BD公司）；一抗HMGA2、GAPDH抗體（美國Abcam公司）；HRP標(biāo)記的二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人DLBCL細(xì)胞系U2932、HBL1、OCI-LY-10及人正常B淋巴細(xì)胞系IM-9購自上海雅吉生物公司，均置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期的OCI-LY-10細(xì)胞，接種于6孔板，按照Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書提供的實(shí)驗(yàn)流程，將miR-195模擬物（miR-195 mimics）、模擬物陰性對(duì)照（NC-mimics）分別轉(zhuǎn)染至OCI-LY-10細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞設(shè)為miR-195 mimics組、NC-mimics組。

1.4 細(xì)胞中miR-195表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。按照TRIzol試劑說明書提取U2932、HBL1、OCI-LY-10、IM-9及miR-195 mimics組、NC-mimics組細(xì)胞總RNA，分光光度儀檢測RNA的濃度及純度。取總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物配置反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取cDNA和PCR引物，按照SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件設(shè)置如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10s，共40個(gè)循環(huán)。miR-195引物上游序列：5′-GGCTAGCAGCACAGAAAT-3′，下游序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物上游序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游序列：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-195的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。取miR-195 mimics組、NC-mimics組細(xì)胞，以5×104/孔接種于96孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時(shí)每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)避光孵育2 h，酶標(biāo)儀測定各孔450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.6 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集轉(zhuǎn)染24 h后的miR-195 mimics組、NC-mimics組細(xì)胞，應(yīng)用1×Annexin V結(jié)合緩沖液懸浮，將5μL PI和5μL Annexin V/FITC的混合物添加到細(xì)胞中并培養(yǎng)孵育25 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞侵襲和遷移能力觀察 采用Transwell小室侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，Transwell小室置于24孔板內(nèi)，小室內(nèi)膜預(yù)先均勻涂抹Matrigel膠凝固成膜。取轉(zhuǎn)染24 h后的miR-195 mimics組、NC-mimics組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，用無血清培養(yǎng)基制成2×104/mL的細(xì)胞懸液，Transwell上室每孔加入200μL細(xì)胞懸液，Transwell下室則加入500μL培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2的條件下經(jīng)過24 h培養(yǎng)后取出Transwell小室，擦除上室內(nèi)膜黏附的細(xì)胞，而后甲醛固定細(xì)胞，染色，倒置光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，Transwell小室內(nèi)膜上不預(yù)先涂抹Matrigel膠，之后進(jìn)行上述同樣操作步驟。以穿膜細(xì)胞數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

1.8 高遷移率族蛋白A2（HMGA2）蛋白檢測 采用Western blotting法。收集mi R-195 mimics組、NC-mimics組細(xì)胞，加入RIPA裂解緩沖液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取等量蛋白樣品，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（微孔膜）上，37℃、5%脫脂牛奶里室溫封閉1 h，4℃下加入一抗HMGA2和GAPDH抗體，4℃培養(yǎng)過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗，ECL發(fā)光試劑顯影，分析條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)胞中miR-195表達(dá)比較 mi R-195在U2932、HBL1、OCI-LY-10及IM-9中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.51±0.15、0.38±0.10、0.27±0.11、1.02±0.04，與IM-9相比，miR-195在U2932、HBL1、OCI-LY-10中表達(dá)降低（P均＜0.05），且在OCI-LY-1中最低。

2.2 兩組OCI-LY-10細(xì)胞中miR-195表達(dá)比較 miR-195 mimics組、NC-mimics組中miR-195的相對(duì)表達(dá)量分別為8.58±0.40、1.02±0.08，兩組比較P＜0.05。

2.3 兩組OCI-LY-10細(xì)胞增殖活性和凋亡率比較 miR-195 mimics組24、48、72、96 h時(shí)細(xì)胞增殖活性低于NC-mimics組（P均＜0.05），見表1。miR-195 mimics組、NC-mimics組細(xì)胞凋亡率分別為（32.65±4.40）%、（6.41±1.33）%，兩組比較P＜0.05。

表1 兩組OCI-LY-10細(xì)胞增殖活性比較（xˉ±s）

2.4 兩組OCI-LY-10細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 miR-195 mimics組、NC-mimics組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（81±26）、（206±56）個(gè)，遷移細(xì)胞數(shù)分別為（126±39）、（383±77）個(gè)，兩組比較P均＜0.05。

2.5 兩組OCI-LY-10細(xì)胞中HMGA2蛋白表達(dá)比較 miR-195 mimics組、NC-mimics組HMGA2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.09、0.92±0.18，兩組比較P＜0.05。

3 討論

DLBCL是一種具有明顯分子和臨床異質(zhì)性的侵襲性疾病。盡管其治療有了顯著進(jìn)展，但患者預(yù)后仍不能令人滿意［2］?？朔l(fā)性耐藥和提高藥物療效是目前DLBCL治療的挑戰(zhàn)。DLBCL的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及不同的遺傳和表觀遺傳變化。目前，基于miRNA的分子靶向治療成為DLBCL治療的新策略。DUE等［12］發(fā)現(xiàn)，DLBCL中miR-155的高表達(dá)與長春新堿敏感性關(guān)系密切，并且miR-155高表達(dá)與DLBCL患者的臨床預(yù)后改善有關(guān)。SUN等［13］發(fā)現(xiàn)，miR-222能夠激活DLBCL細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲。miR-23a［14］、miR-101［15］、mi R-26a［16］等許多miRNA被發(fā)現(xiàn)與DLBCL細(xì)胞的惡性表型有關(guān)，但至今尚未發(fā)現(xiàn)在DLBCL發(fā)生發(fā)展、耐藥過程中起決定性作用的miRNA。

近年來，眾多研究發(fā)現(xiàn)miR-195與腫瘤的形成有關(guān)，并在細(xì)胞凋亡、增殖、遷移和侵襲中起關(guān)鍵作用［7-10］。然而，miR-195在DLBCL中的作用及其機(jī)制尚不清楚。既往研究報(bào)道DLBCL患者腫瘤組織中miR-195表達(dá)降低［11］，本研究發(fā)現(xiàn)DLBCL細(xì)胞中miR-195表達(dá)也降低，提示miR-195的異常低表達(dá)可能與DLBCL的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡是控制腫瘤的有效手段。本研究選擇miR-195表達(dá)最低的OCI-LY-10細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過轉(zhuǎn)染miR-195mimics提高了細(xì)胞中mi R-195的表達(dá)，CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-195 mimics組較NC-mimics組細(xì)胞增殖活性、侵襲和遷移能力下降，而細(xì)胞凋亡率升高，提示上調(diào)miR-195能夠抑制DLBCL的惡性分子生物學(xué)行為。

研究顯示，miRNA在機(jī)體中發(fā)揮的作用與其對(duì)下游靶基因的調(diào)控有關(guān)。在肝細(xì)胞癌［17］、食管癌［18］、肺癌［19］中均發(fā)現(xiàn)mi R-195能夠通過靶向調(diào)控HMGA2的表達(dá)參與腫瘤的形成發(fā)展。HMGA2是目前研究較多的高遷移率族蛋白超家族成員，是在眾多惡性腫瘤中異常高表達(dá)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，被認(rèn)為是重要的癌基因［20］。研究證實(shí)，HMGA2能夠促進(jìn)DLBCL細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［21］。本研究也發(fā)現(xiàn)DLBCL細(xì)胞中HMGA2蛋白的表達(dá)異常升高，上調(diào)OCI-LY-10細(xì)胞中miR-195表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞中HMGA2蛋白的表達(dá)，提示miR-195在DLBCL發(fā)生進(jìn)展中的作用可能與其對(duì)HMGA2蛋白的調(diào)控有關(guān)。

總之，miR-195在DLBCL細(xì)胞中呈低表達(dá)；上調(diào)DLBCL細(xì)胞中miR-195的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，增加細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與miR-195對(duì)HMGA2的靶向調(diào)控有關(guān)。