王鳳霞，司麗娜，魏萌，楊松鶴，程露陽，喬躍兵

承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000

下丘腦作為調(diào)控生殖和能量代謝的高級中樞，其分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）被認(rèn)為是調(diào)節(jié)脊椎動物生殖的惟一下丘腦神經(jīng)肽［1］。2000年，TSUTSUI團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種可以抑制GnRH釋放的新型下丘腦神經(jīng)肽——促性腺激素抑制激素（GnIH）。GnIH可通過其G蛋白偶聯(lián)受體GPR147作用于GnRH神經(jīng)元，抑制促性腺激素合成和釋放［2］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)［3-4］表明，GnIH對GnRH、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、Kisspeptin神經(jīng)元和阿片—促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原（POMC）起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，對神經(jīng)肽Y（NPY）起促進(jìn)作用。可見GnIH是調(diào)節(jié)整個(gè)脊椎動物繁殖和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)不可或缺的要素［5］。但GnIH是否會對下丘腦的其他蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。本研究對卵巢摘除術(shù)補(bǔ)充雌激素（OEP）大鼠側(cè)腦室微量注射GnIH，運(yùn)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）和生物信息學(xué)分析探討GnIH對下丘腦蛋白質(zhì)的影響。另外，經(jīng)CPTAC數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵蛋白在激素相關(guān)性腫瘤中的表達(dá)情況，通過蛋白印跡檢測關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，為探究GnIH與激素依賴性腫瘤的相關(guān)性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 30只成年SD大鼠，雌性，SPF級，體質(zhì)量200～250 g，購自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證號：11401300016009），飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心。室溫維持在25℃左右，通風(fēng)良好。SD大鼠循環(huán)光照12 h、自由飲水、攝食。本實(shí)驗(yàn)所涉及的動物和實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動物倫理管理委員會的要求。

1.1.2 細(xì)胞 將人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7置于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿的80%～90%按1∶2～1∶3進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑與儀器 水合氯醛購于天津博迪化工股份有限公司，苯甲雌二醇購于寧波三生藥業(yè)有限公司，蛋白酶抑制劑（PMSF）購于北京博凌科為生物科技有限公司，GnIH購自美國Peprotech公司，大鼠腦立體定位儀購自日本Narishige公司，D3024R型臺式高速冷凍離心機(jī)購自北京大龍公司，Dionex Ultimate 3000 Nano LC system納升液相色譜系統(tǒng)購于美國戴安公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司，Biological Industries（BI）特級胎牛血清購于以色列生物科技公司，兔單克隆抗體GAPDH、ADPGK分別購于Abcam和Abclon公司，化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建及下丘腦蛋白樣本制備 大鼠行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)14 d后，連續(xù)5 d皮下注射雌激素0.1 mg/（kg·d），建立OEP大鼠模型。保持大鼠體內(nèi)雌激素釋放水平一致，避免雌激素波動對GnIH的負(fù)反饋?zhàn)饔?。造模成功后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，各15例。根據(jù)《The Rat Brain in Ttereotaxic Stereotaxic Coordinates》（第三版）的方法進(jìn)行側(cè)腦室定位：前囟點(diǎn)后1.0 mm，旁開1.5 mm，進(jìn)針深度4.0 mm，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別注射GnIH和生理鹽水（4μL/只，2μg/μL），每30 s注射0.5μL，于4 min完成注射。給藥6 h后取出下丘腦，用PBS清洗并稱重。將下丘腦組織放入研磨儀中，加入組織裂解液和PMSF，低溫研磨，制成勻漿，于4℃12 000 r/min離心30 min，取上清液，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 將下丘腦蛋白樣品酶解，經(jīng)Dionex Ultimate 3000 Nano LC system納升液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行LC-MS/MS分析。色譜柱：Thermo Fisher C18；流動相中A：水，0.1%FA，B：乙腈，0.1%FA；色 譜 柱 類 型C18，規(guī) 格100 mm×75 mm，孔徑300 A，粒徑5μm，流速400 nL/min；梯度：0～65 min，B液線性梯度從5%到80%；0～58 min，B液線性梯度從80%到5%；55～65 min，A液保持100%不變。經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行ESI質(zhì)譜鑒定。分析時(shí)長：65 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1800 m/z；一級質(zhì)譜分辨率：70 000@m/z 200；二級質(zhì)譜分辨率：17 500@m/z 200；多肽和多肽的碎片質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜，得到LC-MS/MS原始數(shù)據(jù)，用Maxquant-1.5.2.0對肽段進(jìn)行非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。

1.2.3 差異蛋白的生物信息學(xué)分析 本研究對非標(biāo)記LC-MS/MS質(zhì)譜分析檢測的原始數(shù)據(jù)，以P＜0.05且差異表達(dá)倍數(shù)≥2為標(biāo)準(zhǔn)，利用Omicsbean（http：//www.Omicsbean.cn）多組學(xué)在線數(shù)據(jù)分析平臺對差異蛋白進(jìn)行基因本體（GO）分析和京都蛋白與蛋白組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO分析包括生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)基于String（https：//string-db.org/）在線數(shù)據(jù)庫檢索差異蛋白，構(gòu)建蛋白—蛋白相互作用（PPI）關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，獲取蛋白互作數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)上傳至Omicsbean（http：//www.Omicsbean.cn）多組學(xué)在線數(shù)據(jù)分析平臺，得到PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 腫瘤中關(guān)鍵蛋白表達(dá)鑒定 經(jīng)生物信息學(xué)分析得到的關(guān)鍵蛋白，聯(lián)合應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫中CPTAC分析程序，輸入關(guān)鍵蛋白名稱，CPTAC數(shù)據(jù)庫選擇乳腺癌，點(diǎn)擊搜索，可顯示蛋白在癌組織與癌旁組織的表達(dá)情況。

1.2.6 關(guān)鍵蛋白ADPGK表達(dá)檢測 應(yīng)用Western blotting法對關(guān)鍵蛋白ADPGK表達(dá)進(jìn)行檢測。取MCF-7對數(shù)生長期細(xì)胞懸液，按GnIH給藥濃度（0、1 000、10 000 ng/mL）接種于底面積為21 cm2的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出各組細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸棄培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的PBS清洗，加適當(dāng)體積的含PMSF的RIPA裂解液于-80℃冰箱過夜。冰上裂解30 min，收集細(xì)胞懸液，置于4℃低溫高速離心機(jī)中以12 000 r/mim離心15 min，取上清。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白上清1/4的Loading Buffer與上清液充分混合，100℃干式孵育器煮10 mim，使蛋白變性，冷卻至室溫-20℃保存。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本（20μg），分離后電流設(shè)定200 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。取相應(yīng)特異性一抗（GAPDH 1∶10 000、ADPGK 1∶2 000）孵育2 h，4℃過夜，復(fù)溫30 min，TBST洗膜緩沖液洗3次，加入HRP熒光標(biāo)記的二抗（1∶8 000），室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL特超敏試劑，經(jīng)Tanon 6100凝膠成像儀掃描顯影。采用Image J軟件分析，通過目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來確定目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有圖表用GraphPad Prism 8制作，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD法，方差不齊時(shí)兩兩比較采用DunnettT3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OEP大鼠模型下丘腦組織中差異蛋白鑒定結(jié)果 鑒定出253個(gè)差異蛋白，其中129個(gè)蛋白（A0A0G2JZR4、 A0A0G2K1D2、 A0A0G2K1J5、A0A0G2K1R5、 A0A0G2K272、 A0A0G2K4N7、A0A0G2K508、 A0A0G2K562、 A0A0G2K5Q0、A0A0G2K5Q2、 A0A0G2K6I0、 A0A0G2K774、A0A0G2K7G7、 A0A0G2K7T5、 A0A0G2K8K0、A0A0G2KAL4、A0A0G2KAW7、A0A0G2KAZ2、A0A0H2UHA6、A0A5D0、A1L114、B1WBM0、B1WC61、B2RYG2、B2RYS8、B3SVE9、B5DF03、C9E895、D3Z955、D3ZA84、D3ZAI6、D3ZCA0、D3ZCI5、D3ZCL8、D3ZHI9、D3ZJK8、D3ZQD3、D3ZVR7、D4A1V1、D4A4P3、D4AA52、D4ACX8、E9PSK7、E9PSL7、F1LNG7、F1LP22、F1LP76、F1LRE1、F1LRT9、F1LUE2、F1M471、F1M5C9、F1M5R3、F1M754、F1MAM6、F2Z3T7、F7EMK8、F8V328、F8WFP9、F8WFS9、G3V734、G3V784、G3V7X2、G3V8G6、G3V918、G3V9S0、M0R6K0、M0R6N2、M0RC99、O09178、O35180、O54755、O88954、P01835、P07153、P09034、P09527、P11348、P11505、P11884、P16446、P18163、P20171、P20760、P21816、P23928、P30835、P34926、P41565、P45479、P62632、P62890、P70549、P84586、P85515、Q03555、Q1W1V7、Q499Q4、Q4QR85、Q5BK32、Q5EBD0、Q5M963、Q5M9F7、Q5XIG8、Q5XIT9、Q5XIW9、Q63604、Q66HG4、Q66HM7、Q68FU2、Q68FX9、Q68G11、Q68G16、Q6AY09、Q6AY30、Q6AYU3、Q6IN14、Q6IRK9、Q6NYB7、Q6P7S1、Q6P7S6、Q8CG45、Q99N27、Q9ERC1、Q9R140、Q9WVJ4、R9TL61）上調(diào)，124個(gè)蛋白（A0A0G2JW58、A0A0G2JW 92、A0A096MJD3、A0A0G2JTG7、A0A0G2JW88、A0A0G2JXC3、 A0A0G2JYW3、 A0A0G2JZM2、A0A0G2K079、 A0A0G2K1A5、 A0A0G2K327、A0A0G2K3P4、 A0A0G2K5C6、 A0A0G2K5E6、A0A0G2K6J5、 A0A0G2K7Y2、 A0A0G2K8I0、A0A0G2K8K9、 A0A0G2K930、 A0A0H2UI35、A0JN17、A1A5L2、A1L1M0、A8WCF8、B0BN18、B2RYJ7、B2RZ79、B3GS92、B3VQJ0、B5DFE0、B6DTP5、D3Z8H0、D3ZGQ3、D3ZIL6、D3ZLH9、D3ZLT1、D3ZRI1、D3ZSL2、D3ZTW9、D3ZUP5、D3ZXF9、D3ZZK3、D3ZZQ0、D4A3B0、D4A4D5、D4A8B3、D4AAF8、D4AE96、E9PSV5、F1LN88、F1LP21、F1LRW6、F1LUV9、F1LX47、F1M7Y3、F7ES73、F7ESM5、F7FKI5、F8WFH8、F8WFM2、G3V6L9、G3V6P7、G3V6S2、G3V803、G3V984、G3V9G3、G3V9Z6、I6L9G6、M0R7Q5、M0R9X8、M0RCV0、O35509、O70419、P04218、P07171、P10362、P11275、P13383、P13852、P20651、P35332、P36201、P51583、P59649、P60522、P62630、P62963、P68403、P97532、Q05140、Q1RP74、Q4KLJ1、Q4KM71、Q4V8E2、Q4V8I7、Q5BJU0、Q5HZV9、Q5RJL0、Q5U1Z9、Q5XI72、Q5XIJ3、Q62861、Q63092、Q63798、Q64538、Q66HM2、Q6DGF2、Q6DUV1、Q6P685、Q6P783、Q6P7A7、Q6S399、Q6XVN8、Q7TQ77、Q7TSD7、Q80W98、Q80Z30、Q810D0、Q920Q0、Q9ERD1、Q9JKT0、Q9QUH6、Q9QXY2、R9PXS4、R9PXU4、R9PXW7）下調(diào)。

2.2 OEP大鼠模型下丘腦組織中差異蛋白的GO功能富集分析 BP有540個(gè)條目顯著富集（P＜0.05），CC有174個(gè)條目（P＜0.05），MF有184個(gè)條目（P＜0.05），見表1。

2.3 OEP大鼠模型的下丘腦差異蛋白的KEGG通路富集分析 KEGG通路富集與本研究關(guān)系較密切的是代謝途徑、糖酵解/糖原異生、內(nèi)分泌和其他因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收、半乳糖代謝等10條主要通路（表2）。

2.4 下丘腦PPI網(wǎng)絡(luò) 有51個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白和92條蛋白相互作用關(guān)系，代謝途徑中有NDUFB8、NDUFB7、OGDHL、FAM213B、NDUFB3、ALDH2、ADPGK、GART、AMPD3、RPN1、ASS1、QDPR、ACSL1、CDO1、PFKL、PPT1、PAICS、MPST、PGM1、CMAS、MCCC2、GALM、ASAH1；糖酵解/糖異生中有ALDH2、ADPGK、PFKL、PGM1、GALM；內(nèi)分泌和其他因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收中有PRKACA、CALB1、ATP2B1、AP2A2；半乳糖代謝中有PFKL、PGM1、GALM；軍團(tuán)菌病中有EEF1A1、EEF1A2、RAB1A；長 時(shí) 程 增 強(qiáng) 中 有PRKACA、CAMK2A、HRAS；壽命調(diào)解途徑—多物種中有PRKACA、HRAS、CRYAB；戊糖磷酸途徑中有PFKL、PGM1；亨 廷 頓 病 中 有NDUFB8、NDUFB7、IFT57、NDUFB3、AP2A2；朊病毒病中有PRKACA、PRNP。綜合分析GO、KEGG和PPI顯示，差異蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2同時(shí)富集于代謝途徑和糖酵解途徑，其中GALM、ADPGK、PGM1、PFKL為上調(diào)蛋白，ALDH2為下調(diào)蛋白。

2.5 CPTAC數(shù)據(jù)庫中關(guān)鍵蛋白在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)比較 節(jié)點(diǎn)蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2在乳腺癌組織中的表達(dá)高于正常乳腺組織，PGM1（P=0.250 0）蛋白表達(dá)高低與乳腺癌患者總體生存期無關(guān)，GALM（P=0.050 0）、ADPGK（P=0.006 0）、PFKL（P=0.006 2）和ALDH2（P=0.009 2）的高表達(dá)與患者總體生存期有關(guān)。

表1 下丘腦組織中差異蛋白的GO功能富集分析

表2 KEGG富集的10條主要信號通路

2.6 GnIH對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中ADPGK表達(dá)的影響 0、1 000、10 000 ng/mL GnIH作用MCF-7細(xì)胞中ADPGK蛋白相對表達(dá)量分別為1.08±0.02、1.17±0.06和1.29±0.16，0與10 000 ng/mL濃度比較P＜0.05。

3 討論

哺乳動物以下丘腦—垂體—性腺軸為主導(dǎo)，通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)且規(guī)律地進(jìn)行著繁殖生理活動［6］。GnIH作為下丘腦—垂體—性腺軸中的重要負(fù)向調(diào)控因子，對生殖神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

本研究對OEP大鼠行側(cè)腦室微量注射GnIH，取下丘腦制備蛋白勻漿，基于非標(biāo)記定量的蛋白質(zhì)組學(xué)，共篩選出差異蛋白253個(gè)，其中129個(gè)蛋白顯著上調(diào)，124個(gè)蛋白顯著下調(diào)。GO結(jié)果顯示，差異蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核有富集，參與單體和小分子代謝過程，并且主要與小分子相互作用，可以和細(xì)胞內(nèi)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)作用對體內(nèi)各種生理功能產(chǎn)生影響。KEGG結(jié)果表明，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路糖酵解途徑在下丘腦差異蛋白中呈現(xiàn)顯著差異性。綜合考慮蛋白的差異變化程度以及蛋白間相互作用的情況，從PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出GALM、ALDH2、ADPGK、PGM1、PFKL為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白，且其共同參與腫瘤相關(guān)的糖酵解途徑。

糖酵解途徑作為代謝途徑之一，與腫瘤［7］、生殖［8］和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)［9］有關(guān)，并為機(jī)體提供生命活動所需能量。在激素依賴性乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞的葡萄糖攝取通過激活糖酵解表型而增加癌基因Akt的表達(dá)，Akt激酶活性的增加大多與預(yù)后不良有關(guān)［10］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的差異蛋白富集糖酵解通路結(jié)果，推測GnIH可能通過糖酵解途徑影響激素依賴性相關(guān)生殖神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。在生物體中，蛋白質(zhì)并不是獨(dú)立存在的，其功能的行使必須借助于蛋白質(zhì)間的相互作用來調(diào)節(jié)和介導(dǎo)［11］。磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解途徑中最關(guān)鍵的限速酶，且PFK分為PFKM、PFKL和PFKP三種亞型，PFKL是篩選出的節(jié)點(diǎn)蛋白。研究表明，PFKL過表達(dá)導(dǎo)致葡萄糖攝取增加和乳酸的產(chǎn)生，促進(jìn)糖酵解［12］。另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制PFKL的表達(dá)會抑制細(xì)胞增殖和致瘤性，如在雌激素相關(guān)的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)雌激素通過激活PI3K-Akt途徑刺激糖酵解，誘導(dǎo)PFKL表達(dá)增加，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生［13-14］。ALDH2作為一種乙醇代謝重要的酶，處于糖酵解/糖異生信號通路的核心位置［15-16］。ALDH2活性的降低和由此產(chǎn)生的較高濃度的乙醛可能是乙醇誘發(fā)癌癥的危險(xiǎn)因素［17］。研究發(fā)現(xiàn)，在飲酒誘發(fā)的卵巢癌［18］和乳腺癌［19］中，ALDH2表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致乙醛暴露增加，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。除了對腫瘤產(chǎn)生影響外，在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)也發(fā)揮著作用。研究顯示，ALDH2表達(dá)增高可促進(jìn)瘦素［20］和促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原［21］表達(dá)增高。PGM1是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，通過催化1-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的相互轉(zhuǎn)化維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)［22］。研究發(fā)現(xiàn)，組織細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)需要攝取大量葡萄糖，PGM1在激素依賴性子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，PGM1為腫瘤細(xì)胞持續(xù)生長提供能量［23-24］。此外，在人類卵巢巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，PGM1表達(dá)增多可促進(jìn)黃體退化，說明PGM1與雌孕激素的分泌和釋放密切相關(guān)［25］。ADPGK利用ADP作為磷酸供體催化葡萄糖非陽離子磷酸化為葡萄糖6-磷酸［26］，參與糖酵解途徑對能量代謝起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在激素依賴性腫瘤的前列腺癌和乳腺癌中ADPGK高表達(dá)，ADPGK高表達(dá)可以驅(qū)動糖酵解使葡萄糖攝取增加，促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲［27-29］。GALM是參與半乳糖調(diào)節(jié)的重要相關(guān)酶。研究發(fā)現(xiàn)，GALM對人癌細(xì)胞生長有較強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量依賴性，其機(jī)制可能與Caspase-12的表達(dá)增加有關(guān)［30］。

乳腺癌屬于激素依賴性腫瘤，雌激素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選用雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞系驗(yàn)證，經(jīng)GnIH作用后下丘腦關(guān)鍵蛋白ADPGK與MCF-7細(xì)胞系的ADPGK蛋白表達(dá)及功能行使是否一致，探索GnIH與激素依賴性腫瘤之間的關(guān)系。研究顯示，ADPGK可催化葡萄糖-6-磷酸的生成，葡萄糖-6-磷酸是所有生命代謝的中心反應(yīng)［26］。在組織水平，側(cè)腦室微量注射GnIH后蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析顯示下丘腦差異蛋白ADPGK表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)糖酵解使下丘腦獲得足夠的能量并加速代謝。另有研究表明，ADPGK在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出促生存和抗凋亡作用［31］。在細(xì)胞水平，GnIH給藥后經(jīng)蛋白免疫印跡驗(yàn)證MCF-7細(xì)胞中ADPGK蛋白相對表達(dá)水平下降，與其他研究者結(jié)果一致。從以上結(jié)果可推測，在正常組織中GnIH可能通過糖酵解途徑上調(diào)下丘腦蛋白ADPGK促進(jìn)代謝，而在腫瘤細(xì)胞中GnIH可發(fā)揮抑制ADPGK蛋白的表達(dá)達(dá)到促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用。

綜上可見，GnIH通過參與葡萄糖攝取的糖酵解途徑，影響GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2的表達(dá)，之后經(jīng)過一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反饋調(diào)節(jié)促性腺激素合成和釋放以支持生物體活動，這可為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的激素依賴性腫瘤的診斷與治療提供更多的策略。